尼可地尔对APPsw/SH-SY5Y细胞氧化应激和Aβ生成影响的研究

孔晶晶,张多多

(1.大连医科大学附属第一医院 老年医学科，辽宁 大连 116011；2.大连医科大学附属第一医院 心律失常科，辽宁 大连 116011)

随着人口老龄化进程，阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的发病率逐年升高，目前仍缺乏有效的药物治疗。AD的病因尚不明确，大量证据表明自由基生成过多引起的氧化应激反应是AD神经病理改变的主要致病因素[1]。氧化应激通过激活β-分泌酶促进β淀粉样肽(β-amyloid peptide，Aβ)的产生[2]，Aβ可以通过多种途径诱导活性氧产生，生成过多的氧自由基，引起细胞氧化应激性损伤。提示氧化应激反应和Aβ的产生和聚集有着密不可分的作用。目前关于ATP敏感性钾通道(ATP sensitive potassium channel，KATP)开放剂对AD细胞模型氧化应激和Aβ生成的影响和机制的研究，相关报道较少。

PI3K/AKT信号通路是细胞内重要的促细胞存活的通路之一，糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)一个多功能的丝氨酸/苏氨酸激酶，它是PI3K/Akt信号通路下游的一个关键靶点，活化的Akt通过磷酸化GSK-3β的Ser9残基使得GSK-3β失活。而GSK-3β对于神经细胞凋亡，tau蛋白磷酸化，Aβ的生成均有着重要的调节作用[3-4]。

本文以首个应用于临床的KATP开放剂尼可地尔为研究药物，构建高表达瑞典突变型淀粉样前体蛋白的神经母细胞瘤细胞作为AD的体外细胞模型，研究尼可地尔对AD细胞模型氧化应激和Aβ生成的影响，并探讨PI3K/AKT/GSK-3β通路在尼可地尔参与氧化应激、Aβ生成调节中的可能分子机制。

1 材料和方法

1.1 材 料

人神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞购自中科院上海细胞库。pcDNA3.1-APP695swe质粒由北京赛诺科为科技有限公司设计并合成，APP695swe序列参照http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/A33292.1设计合成，阴性对照组为空质粒pEGFPN1质粒。尼可地尔(SantaCruz)，格列本脲(SantaCruz)，LY294002(Sigma)，Lipofectamine 2000(Invitrogen)，SOD,GSH-PX,MDA试剂盒(南京建成)，β-actin-HRP鼠抗人单克隆抗体(上海康成)，Akt，p-Akt，GSK-3β，p-GSK-3β兔抗人多克隆抗体(Bioworld)，APP695兔抗人多克隆抗体(武汉博士德)，羊抗兔IgG-HRP(碧云天)，人Aβ1-42ELISA试剂盒(CUSABIO)，总RNA提取试剂盒(TIANGEN)，TIANScript RT kit(TIANGEN)，APP695上下游引物(上海生工)，β-actin上下游引物(上海生工)。

1.2 细胞培养和细胞转染

SH-SY5Y细胞培养在含10%胎牛血清、100 U/mL氨苄青霉素及100 U/mL链霉素的DMEM培养基中，于37 ℃、5% CO2浓度下培养。细胞转染按照lipofectimineTM2000说明书进行操作。

1.3 药物处理和分组

取对数生长期的SH-SY5Y细胞，瞬时转染APP695swe质粒或空质粒，分为APPsw质粒组和空质粒组(NC组)，转染24 h后加药物处理24 h。尼可地尔(1 mmol/L)，格列本脲(10 μmol/L)，LY294002(10 μmol/L)需提前1 h预处理，分组如下：APPsw质粒组+尼可地尔，APPsw质粒组+格列本脲，APPsw质粒组+尼可地尔+格列本脲，APPsw质粒组+LY294002，APPsw质粒组+尼可地尔+LY294002，APPsw质粒组(APPsw质粒对照组)，空质粒组(NC组)。

1.4 细胞内丙二醛(MDA)，总超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，还原型谷胱甘肽 (glutathione，GSH)的测定

药物处理24 h后收集各组细胞，加入PBS用移液器打散至单细胞悬液，液氮反复冻融3次，使细胞破碎。12000 r/min离心10 min，上清为细胞匀浆液，BCA法蛋白定量。按照MDA,SOD,GSH检测试剂盒说明书进行操作，酶标仪分别在532 nm，550 nm，420 nm波长处记录吸光度值，根据公式计算MDA，GSH的含量，总SOD的活力值。

1.5 Realtime-PCR定量检测APP695mRNA

用总RNA提取试剂盒提取样本总RNA。用TIANScript RT Kit对所得RNA样本反转录成cDNA，反应条件：70 ℃ 5 min，42 ℃ 50 min，95 ℃ 5 min。β-actin为内参基因，APP695和β-actin引物信息见表1。PCR反应条件：95 ℃ 10 min预变性，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s,进行 45个循环。荧光定量仪进行荧光定量分析。利用2-△△CT方法计算目的基因的相对表达量。

1.6 ELISA试剂盒检测细胞外液Aβ1-42水平

药物作用24 h后收集各组细胞培养液，按照Human Aβ1-42ELISA试剂盒说明书操作。加入待测样本和标准品每孔100 μL(设重复孔), 覆上板贴，37 ℃温育2 h；弃液，甩干，不洗涤；每孔加入生物素标记抗体工作液100 μL，覆上新板贴，37 ℃温育1 h；弃液，甩干，洗板3次；每孔加入辣根过氧化物酶标记亲和素抗体工作液100 μL，覆上新板贴，37 ℃温育1 h；弃液，甩干，洗板3次；加入底物溶液90 μL，37 ℃避光显色30 min；加入终止溶液50 μL，终止反应；酶标仪在450 nm处记录吸光度值，绘制曲线，计算Aβ1-42浓度。

表1 引物序列表

1.7 Western blot 检测目的蛋白表达

药物作用24 h后收集各组细胞，冰上裂解，加入NP-40裂解液(使用前加入PMSF，使之终浓度为1 mmol/L)，匀浆，冰上静置30 min后，12000 r/min，4 ℃，离心15 min，收集总蛋白，BCA法蛋白定量。取样品40 μg进行SDS-聚丙乙烯酰胺凝胶电泳，待转至纤维素膜后，用含1% BSA的TTBS封闭1.5 h；一抗：兔抗人APP695(1∶1000)，p-AKT (1∶1000)，AKT (1∶1000)， GSK-3β(1∶1000)，p-GSK-3β (1∶1000)，鼠抗人β-actin-HRP(1∶10000) 4 ℃孵育过夜；用TTBS洗膜5 min×3次后，加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔的二抗 (1∶5000)，37 ℃孵育45 min。TTBS洗膜5 min×6次，ECL法显影，凝胶成像分析仪采集结果。

1.8 统计学方法

所有数据以x±s表示，应用SPSS17.0软件，两均数比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析，P<0.05有统计学意义。

2 结 果

2.1 APPsw细胞APP695蛋白表达和Aβ分泌情况

Western blot结果显示(图1A)：APPsw质粒组在转染24 h，48 h和72 h后的APP695蛋白表达均明显高于NC组(P<0.05)，且有明显的时间依赖性(P<0.05)。ELISA结果显示(图1B)：APPsw质粒组在转染24 h，48 h和72 h后细胞外液Aβ1-42的水平均明显高于NC组(P<0.05)，呈明显时间依赖性(P<0.05)。

A:Western blot结果示APP695蛋白表达情况；B:ELISA结果示Aβ1-42表达情况。**与NC组相比，P<0.01图1 瞬时转染细胞APP695蛋白和细胞外液Aβ1-42的表达Fig 1 APP695 expression in transiently transfected cells and Aβ1-42 levels in the medium

2.2 尼可地尔对APPsw细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)水平的影响

结果显示(图2)：与NC组相比，APPsw质粒对照组脂质过氧化产物MDA明显升高，还原型谷胱甘肽GSH水平明显降低，总SOD水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。而尼可地尔处理组明显降低MDA的生成，而增加总SOD，GSH的水平，差异有统计学意义(P<0.05)；且KATP阻断剂格列本脲可以阻断上述保护效应(P>0.05)。

A:MDA; B:总SOD；C：GSH。*与APPsw质粒对照组相比，P<0.05；**与APPsw质粒对照组相比，P<0.01；##与NC组相比，P<0.01图2 尼可地尔对APPsw细胞内MDA、总SOD、GSH水平的影响Fig 2 Effects of nicorandil on the activity of MDA,total SOD,GSH in APPsw cells

2.3 尼可地尔对APPsw细胞APP695 mRNA表达的影响

Real-time PCR结果显示(图3A)：APPsw质粒对照组APP695 mRNA表达水平较NC组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；尼可地尔处理组明显降低APP695 mRNA的表达，差异有统计学意义(P<0.05)，尼可地尔+格列本脲处理组与APPsw质粒对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 尼可地尔对APPsw细胞APP695蛋白表达的影响

Western blot结果显示(图3B)：APPsw质粒对照组APP695蛋白的表达水平较NC组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；尼可地尔处理组明显降低APP695蛋白的表达，差异有统计学意义(P<0.05)，尼可地尔+格列本脲处理组与APPsw质粒对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.5 尼可地尔对APPsw细胞Aβ分泌水平的影响

ELISA结果显示(图3C)：APPsw质粒对照组细胞外液Aβ1-42的表达水平较NC组明显升高(P<0.05)，尼可地尔处理组明显降低细胞外液Aβ1-42的分泌水平，差异有统计学意义(P<0.05)，尼可地尔+格列本脲处理组与质粒对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。

A:Real-time PCR结果示APP695 mRNA表达情况；B：Western blot结果示APP695蛋白表达情况；C：ELISA结果示Aβ1-42表达情况。*与APPsw质粒对照组相比，P<0.05，**与APPsw质粒对照组相比，P<0.01，##与NC组相比，P<0.01图3 尼可地尔对APPsw细胞APP代谢的影响Fig 3 Effects of nicorandil on APP processing in APPsw cells

2.6 尼可地尔对APPsw细胞PI3K/Akt/GSK-3β信号通路的影响

Western blot结果显示：尼可地尔可以明显升高p-Akt的表达水平(P<0.05)，而总的Akt水平没有变化(P>0.05)，尼可地尔+LY294002处理组与质粒对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)(图4A)。尼可地尔可以明显上调p-GSK-3β/GSK-3β的比值(P<0.05)，尼可地尔+LY294002处理组与质粒对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)(图4B)。

A：p-Akt/Akt; B:p-GSK-3β/GSK-3β。**与APPsw质粒对照组相比,P<0.01，##与NC组相比,P<0.01图4 尼可地尔对APPsw细胞PI3K/Akt/GSK-3β信号通路的影响Fig 4 Effects of nicorandil on PI3K/Akt/GSK-3β signaling pathway in APPsw cells

3 讨 论

本研究应用APP695swe质粒瞬时转染SH-SY5Y细胞，诱导SH-SY5Y细胞高表达APP695，并分泌高水平的Aβ40，Aβ42，来模拟AD的病理过程，作为较理想的AD细胞模型[5]。本研究发现尼可地尔处理可以明显提高APPsw细胞内总SOD活性，增加GSH水平，降低MDA水平，提示尼可地尔可以提高AD细胞模型的抗氧化能力，降低脂质过氧化水平，减轻氧化应激性损伤。同时，尼可地尔可以降低APPsw细胞APP695 mRNA和APP695蛋白的表达，并减少Aβ1-42的生成，KATP阻断剂格列本脲可以抵消这一作用。这提示激活KATP通道可以抑制APPmRNA和APP蛋白的表达，并能减少Aβ的生成。

早有研究报道[6]神经元APP mRNA的表达和APP蛋白的合成是有神经元电活动依赖性的，APP的合成和代谢是受神经细胞去极化状态，细胞内Ca2+内流所调控。神经元被剥夺去极化，细胞内Ca2+内流减少，可以减少APP mRNA的表达和APP蛋白的合成。相反，神经元去极化，细胞内Ca2+内流增加，可以使APP mRNA表达和APP蛋白合成增多。本研究结果可以用上述机制解释：尼可地尔通过激活KATP通道，导致细胞内K+外流增加，神经元处于超极化状态，从而减少细胞内Ca2+内流，均可减少APP695 mRNA和APP695蛋白的表达。APP695蛋白表达减少，Aβ的生成也随之减少。

越来越多的证据表明增加的氧化应激反应发生在Aβ沉积之前或者伴随Aβ沉积的过程中[7]。同样观点认为氧化应激既是Aβ产生的原因也是结果[8]。这提示氧化应激反应和Aβ的产生和聚集有着密不可分的作用。氧化应激反应可以增加β-分泌酶的表达并可增加β-分泌酶或γ-分泌酶的活性从而促进Aβ的生成[2,9-10]，而Aβ生成可以导致氧化应激反应增加和神经细胞能量代谢障碍。实验性的减少神经元能量供应，或者增加氧化应激反应均可以使得Aβ生成明显增多。相反，限制热量供应，用抗氧化剂干预治疗减少脑内的氧化应激反应，则可减少AD小鼠脑内Aβ的生成和聚集[11-13]。Liu等[14]证实mitoKATP开放剂二氮嗪治疗3xTgAD小鼠可以明显减少海马和大脑皮层神经元的Aβ的沉积。推测二氮嗪也许通过降低神经元的兴奋性，激活NMDA受体，改善线粒体能量代谢，减少氧化应激等途径来减少Aβ的生成。

GSK-3β也是PI3K/Akt信号通路下游的一个关键靶点，GSK-3β与Aβ代谢密切相关。在GSK-3β的转基因鼠研究中发现，脑内Aβ生成明显增加，这提示GSK-3β参与调节APP的代谢过程[15]。选择性的GSK-3β抑制剂氯化锂，可以减少GSK-3β的表达，抑制由GSK-3β引起的细胞凋亡，并减少Aβ40/42的生成[16]。体内和体外实验也证实，丙戊酸也同样是GSK-3β抑制剂，可以通过抑制GSK-3β调节的γ-分泌酶水解APP，减少Aβ的生成。丙戊酸治疗转基因AD小鼠模型，可以减少老年斑的形成，并可以改善AD小鼠记忆的缺陷[17]。本研究证实KATP开放剂尼可地尔可以激活PI3K/Akt信号通路，磷酸化GSK-3β从而使GSK-3β失活，也能很好的解释尼可地尔减少AD细胞模型Aβ生成的机制。

综上，尼可地尔很可能通过减少AD细胞模型的氧化应激反应，从而抑制β-或γ-分泌酶的水解，减少Aβ的生成；同时激活KATP可以使神经元超极化，细胞内Ca2+内流减少，抑制APP695 mRNA和APP695蛋白的生成，最终也减少Aβ的生成。另外，激活PI3K/AKT通路使GSK-3β失活，也可最终导致Aβ生成的减少。