凋亡及凋亡相关因子在胎儿生长受限胎盘滋养细胞中的表达

姜 丹，于晶功，孙寒冰，于 水，邹 娜,刘远远,蒋 奇,王梦瑶

(1.大连市妇女儿童医疗中心 病理科，辽宁 大连 116000；2.大连市妇幼保健院 病理科，辽宁 大连 116033)

胎儿生长受限(fetal growth restriction，FGR)是妊娠晚期胎儿出生体重低于同孕龄胎儿平均体重的二个标准差或十百分位数,是常见产科并发症及围产儿死亡的第二大原因，其病因主要包括母体营养供应，胎盘转运和胎儿遗传等方面，还有一部分约占40%为不明原因的FGR[1]，其发病机制尚不明确。目前认为不明原因的FGR发生的病理基础为胎盘滋养细胞侵袭障碍。胎盘绒毛纤维沉着增加，绒毛间质增生，钙化，纤维素样坏死增多，绒毛血管减少或消失，部分血管壁增厚，管腔狭窄，甚至闭塞，母体无法通过胎盘供应充足的血液给胎儿[2]。有研究证实在妊娠的整个阶段均存在凋亡，胎盘滋养细胞凋亡异常与滋养细胞侵袭障碍关系密切[3]。Fas/Fasl是细胞外凋亡途径起始因子及其识别机制的主要死亡受体和死亡配体[4]。本实验通过比较正常妊娠晚期与FGR胎盘滋养细胞凋亡及凋亡相关因子Fas、Fasl的表达，探讨它们在FGR发生发展中的作用及意义。

1 材料和方法

1.1 材料来源

选取2014年3月至2017年3月大连市妇女儿童医疗中心正常妊娠晚期(对照组)及临床诊断为FGR产妇(实验组)胎盘各50例，除外患有其它内科或产科并发症者，产妇年龄25～33岁(30.3±2.5)岁，孕周34～40周(36.5±2.3)周。所有产妇均为单胎剖宫产, 无不良嗜好，无特殊病史，产儿均为活胎。所选实验组及对照组产妇年龄、孕周差异无统计学意义(P>0.05)。胎盘取材均经产妇知情同意，送检胎盘分别生理盐水洗涤3次后10%中性福尔马林液固定，常规取材、石蜡包埋、切片。

1.2 检测方法

1.2.1 原位末端标记法(TUNEL)检测胎盘滋养细胞的凋亡:参考罗氏凋亡试剂盒说明书，切片脱蜡、水化、漂洗，蛋白酶K孵育30 min，过氧化氢浸泡5 min，TUNEL反应液暗室37 ℃孵育60 min，PBS冲洗终止反应，滴加Converter-POD于37 ℃水浴箱中孵育30 min，最后DAB显色10 min，苏木素复染，封片。光学显微镜下观察胎盘滋养细胞的凋亡程度，计算滋养细胞凋亡指数。罗氏Tunel凋亡检测试剂盒购自基因科技(上海)有限公司。

1.2.2 免疫组化S-P法检测凋亡相关因子Fas、Fasl在胎盘滋养细胞中的表达:参考基因科技Fas、Fasl免疫组化试剂盒说明书，切片常规脱蜡水化，抗原修复，冲洗，过氧化物酶阻断剂孵育10 min，加一抗，室温60 min后，PBS冲洗，加二抗室温30 min后，PBS冲洗，DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，封片，光学显微镜下观察并拍照。鼠抗人Fas单克隆抗体、兔抗人Fasl 单克隆抗体、SP免疫组化试剂盒、DAB染色液(聚合物法)均购自基因科技(上海)有限公司。

1.3 结果判定

凋亡细胞：光学显微镜下核为棕褐色或棕黄色，细胞核呈不同程度的固缩，形态结构多样，可呈圆形、分叶状、或不规则形。凋亡小体：细胞膜皱缩内陷，分割包裹细胞质，形成泡状、花环状小体。凋亡指数：每张切片连续选取5个高倍 (×400)视野计算平均凋亡细胞所占细胞总数的百分比即为凋亡指数：AI=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

免疫组化半定量:光学显微镜下组织细胞膜或细胞浆中有棕黄色颗粒沉积为阳性细胞。每张切片随机选取10个高倍(×400)视野，按照每张切片的阳性细胞的比例以及着色的深浅进行半定量的分析。阳性细胞着色比例A：<5%，0 分；5%～25%，1 分；26%～50%，2 分；>50%，3 分；着色强度B：无着色或背景染色，0 分；浅棕黄色，1 分；棕黄色，2 分；棕褐色，3 分。积分=A×B，积分0 分记(﹣)；积分1～3 分记(+)；积分4～6 分记(++)；积分7～9 分记(+++)，两位病理科专职人员检测结果的平均值作为最终结果记录。

1.4 统计学方法

采用SPSS23.0软件包进行统计学分析。临床资料年龄及孕周分析、凋亡指数比较均采用均数的t检验；Fas、Fasl的表达强度用等级资料秩和检验；AI与Fas、Fasl之间相关性分析采用Spearman非参数相关分析；P<0.05记差异有统计学意义的检验标准。

2 结 果

2.1 滋养细胞的凋亡情况

Tunel凋亡检测示:两组均可见到凋亡细胞，实验组多于对照组。两组凋亡指数分别为(17.64±6.97)%及(56.48±7.98)%，AI在实验组比对照组增加，且差异有明显的统计学意义(P<0.05)。见图1。

2.2 凋亡相关因子Fas、Fasl的表达

Fas、Fasl在对照组与实验组中均见表达，主要表达于滋养细胞细胞膜、细胞浆或蜕膜组织中。实验组胎盘Fas表达高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1，图2A、2B。实验组Fasl表达低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1，图3A、3B。

A：实验组,凋亡细胞染为棕褐色或棕黄色，细胞体积缩小，细胞固缩，染色质浓缩，细胞核为分叶形或不规则性，甚至核碎裂。凋亡小体如花环状或泡状小体(箭头示);B：对照组,未见明显凋亡细胞 图1 滋养细胞的凋亡检测(×400)Fig 1 Apoptosis of placental trophoblast in experimental and control groups(×400)

组别nFas-++++++阳性(%)Fasl-++++++阳性(%)对照组501490098001337100实验组5000248100028220100

采用等级资料秩和检验，正常组与实验组相比： Fas：Z=-9.461，P=0.000；Fasl：Z=-9.162，P=0.000

A:实验组，终末绒毛纤维素样坏死，合体结节增多，Fas表达于滋养细胞细胞膜及细胞浆，70%左右细胞中等至强阳性，染色为棕黄色至棕褐色；B：对照组， Fas表达示80%左右细胞弱阳性，染色为浅黄色图2 两组胎盘滋养细胞Fas表达情况(×200)Fig 2 Fas expression in placental trophoblast in experimental and control groups(×200)

A：实验组，Fasl表达于滋养细胞细胞膜及细胞浆80%左右细胞示弱阳性，染色为浅黄色；B：对照组，Fasl 80%左右细胞中等至强阳性，染色为棕黄色至棕褐色图3 两组胎盘滋养细胞Fasl表达情况(×200) Fig 3 Fasl expression in placental trophoblast in experimental and control groups(×200)

2.3 实验组 Fas、Fasl表达程度与滋养细胞凋亡程度的相关性分析

实验组AI与Fas表达呈正相关(r=0.634,P=0.000)；与Fasl表达呈负相关(r=-0.940,P=0.000)，差异有统计学意义 。

3 讨 论

FGR是产科常见并发症，目前已明确的主要病因包括母体因素，胎儿遗传发育因素，胎盘因素，还有一部分病因不明确。FGR不仅会引起严重的围产期并发症，从长远看还会影响儿童智力发育及心理健康[5]。胎盘是介于胎儿和母体之间进行物质交换的重要器官，胎盘血液灌注不足及功能低下，胎盘一系列病理生理变化均可能在FGR的发病中起着重要作用[6]。有研究指出病因不明的FGR胎盘中存在凋亡基因[7]，可以使凋亡增加，导致胎盘功能异常，滋养细胞侵袭障碍，从而影响胎盘对胎儿的血供，导致FGR的发生。本研究通过TUNEL法检测，发现FGR胎盘滋养细胞存在凋亡增加的现象。

细胞凋亡又称程序性的细胞死亡，是多细胞个体正常成熟发育、维持生理过程所必需的生物学现象[8]。有研究表明，在整个妊娠过程，孕妇胎盘都在发生着不同程度的细胞凋亡，妊娠早期，细胞生长大于细胞凋亡，有利于胎儿的生长发育，随着妊娠期进展，凋亡程度不断增加，有利于胎儿顺利娩出[9]。胎盘细胞的增殖和凋亡保持动态平衡维持胎盘的正常功能，凋亡的异常引起胎盘功能障碍，病理妊娠的发生[10]。本研究通过实验证明FGR胎盘滋养细胞存在凋亡增加，可能使胎盘失去自身功能平衡，导致FGR发生。细胞凋亡是多因素共同调节的复杂过程，影响FGR胎盘滋养细胞凋亡的相关调控因子主要有哪些，他们对FGR胎盘凋亡有什么影响，值得我们进一步深入探讨和研究。

Fas 是I 型跨膜糖蛋白,神经生长因子(NGF)/肿瘤坏死因子超家族，它是介导凋亡的细胞表面受体，主要存在于T淋巴细胞为主的多种组织细胞。Fas配体(Fasl)属于肿瘤坏死因子家族，是II型跨膜糖蛋白，与细胞表面Fas结合，使表达Fas的组织细胞发生凋亡[11]。正常妊娠期辅助T淋巴细胞调节免疫使机体微环境适应胎儿的生存及发育。T淋巴细胞因子调节失衡会引起病理妊娠的发生。Fas/Fasl共同诱导细胞凋亡，Fas 信号的传导效应依据效应细胞的分化和活性状态, 介导两种相反的效应,在激活早期，加强效应细胞的活性, 在晚期，则诱导细胞凋亡[12]。Fas/Fasl的相互作用及介导的信号途径, 是目前研究细胞凋亡的主要内容之一, 其调控凋亡的机制尚不清楚, 但已确认Fas/Fasl是细胞外凋亡途径起始因子及其识别机制的主要死亡受体和配体[13]。近年来研究发现Fas/Fasl介导的细胞凋亡与T淋巴细胞免疫调节关系密切，可能在母儿免疫耐受中有重要作用。在妊娠期，母体内出现很多异体抗原，T淋巴细胞被激活，大量表达Fas，而Fasl的作用和Fas相反，它与Fas结合后，导致激活的T淋巴细胞发生凋亡从而保护胎儿生长发育[14]。本研究中Fas、Fasl在对照组与实验组中均见表达，主要表达于滋养细胞细胞膜、细胞浆及蜕膜组织中，实验组胎盘滋养细胞Fas表达明显高于对照组，Fasl表达明显低于对照组。凋亡相关因子Fas、Fasl可能共同参与实验组滋养细胞的凋亡异常过程，引起凋亡增加，且实验组凋亡指数AI与Fas表达呈正相关，与Fasl表达呈负相关性。Fas的高表达及Fasl的低表达导致胎盘滋养细胞凋亡增加，侵袭障碍，胎盘功能不全，胎盘供血不足，胎儿生长发育受限。

随着二胎政策的开放，高龄产妇增多，FGR发病率日渐增加，FGR是一个复杂的病理妊娠过程，病因多不明确，深入探讨FGR发病机制，研究凋亡在FGR发生的意义，可能为FGR病因学提供新的研究思路，为临床治疗FGR提供研究新靶点，从长远看正确的诊断早期的干预可能会降低FGR新生儿并发症及死亡率，加强优生优育。