冰片对丹参脂溶性药效成分促吸收作用研究*

周陆怡，鲁澄宇

（广东医科大学药学院，广东 东莞 523808）

丹参Salvia miltiorrhizaBeg.为唇形科植物丹参的干燥根，具有扩张冠脉、增加冠脉血流量、防止心肌缺血和心肌梗死、改善微循环、保护心脏等作用［1］。二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA是丹参脂溶性的主要活性成分［2-3］。冰片为常用的中药促吸收剂，可促进药物吸收和促进血脑屏障开放［4］，提高其他药物的生物利用度［2］。丹参总酮难溶于水［5］、口服难吸收［6］、生物利用度低［7-8］、不易透过血脑屏障［9-10］的特点，极大地限制了丹参酮类药物制剂的临床应用。目前，国内外针对冰片促进血脑屏障开放的作用进行了研究［11］，但鲜有冰片同时对多种丹参脂溶性药效成分在体内组织分布的影响研究。本研究中探讨了冰片同时对多种丹参脂溶性药效成分促吸收和组织分布的影响，从药物代谢动力学的角度阐明使药冰片对君药丹参的协同增效作用，为指导开发易吸收、生物利用度高的口服型丹参制剂提供参考。

1 仪器、试药及动物

仪器：Agilent1200型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；可调式微量移液器（德国 eppendorf公司）；eppendorf5417r型高速冷冻离心机（德国eppendorf公司）；auy120型电子天平（日本shimadzu公司）；真空采血管肝素抗凝管（君威医疗设备有限公司）。

试药：丹参醇提物（西安鸿生生物技术有限公司，批号为20121107）；冰片（分析纯，湖南株洲林化厂，批号为201208）。甲醇（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；乙酸乙酯（分析纯，广东光华科技股份有限公司）；生理盐水（湖北兴华制药有限公司）；二氢丹参酮Ⅰ（批号为 A0060）、隐丹参酮（批号为110852-200806）、丹参酮Ⅰ（批号为 110867-200406）和丹参酮ⅡA（批号为110766-200619）对照品，丙酸睾酮（内标，批号不100008-201206）均购自中国食品药品检定研究院。

动物：SPF 级 SD 大鼠，雄性，体质量（220±10）g，20只，由广东省实验动物中心提供，动物合格证号为scxk（粤）2015-0007，健康状况良好。实验方法和目的符合人类道德伦理标准，实验过程中对动物的处置符合2006年科学技术部发布的关于善待实验动物的指导性意见。

2 方法与结果

2.1 给药方法与样品采集

SD大鼠随机分成2组，每组10只，实验前12 h禁食，自由饮水。冰片组灌胃丹参醇提物混悬液100 mg／kg，然后立即灌胃冰片100 mg／kg；未加冰片组灌胃丹参醇提物混悬液100 mg／kg，然后立即灌胃乙醇 1 mL／kg。灌胃30 min后处死大鼠，取血液、脑和心脏，待处理。

2.2 生物样品处理

取血液，以3 000 r／min离心10 min分层，取淡黄色上清液即血浆0.5 mL，加入50 μL甲醇，加入内标溶液5 mg／L的丙酸睾酮内标溶液50 μL，涡旋混合器混旋 1 min，3 000 r／min离心 5 min，将上清液转移离心试管中，加入2.5 mL（5倍体积比）乙酸乙酯，涡旋1 min，3 000 r／min离心5 min分层，吸取上层有机相，30℃水浴下氮气，吹干。残渣用100 μL流动相溶解，涡旋1 min，13 200 r／min 高速离心 10 min，0.45 μm 微孔滤膜过滤后进样 20 μL。

取脑组织或者心脏组织，加入1∶5（g／mL）的质量体积比的生理盐水，加入50 μL甲醇，加入内标溶液5 mg／L的丙酸睾酮内标溶液50 μL，匀浆，涡旋混合器混旋1 min，3 000 r／min离心5 min，将上清液转移离心试管中，加入5倍体积质量比的乙酸乙酯，涡旋1 min，3 000 r／min离心5 min分层，吸取上层有机相，30℃水浴下氮气吹干。残渣用100 μL流动相溶解，涡旋1 min，13 200 r／min 高速离心 10 min，0.45 μm 微孔滤膜过滤后进样 20 μL。

2.3 测定方法的建立

2.3.1 色谱条件

色谱柱：Waters Symmetry C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：水 - 甲醇（22 ∶78）；流速：0.8 mL ／min；检测波长：244 nm（二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅰ和丙酸睾酮），266nm（隐丹参酮和丹参酮ⅡA）；柱温：25℃。

2.3.2 溶液制备

取二氢丹参酮Ⅰ对照品2.90 mg，隐丹参酮对照品8.40 mg，丹参酮Ⅰ对照品 3.30 mg，丹参酮ⅡA对照品8.60 mg，精密称定，用甲醇定容至10 mL，即得对照品的混合贮备液。精密吸取混合贮备液各1 mL，用甲醇定容至10 mL，即得二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA质量浓度分别为 29.0，82.9，33.0，86.0 mg／L的混合标准溶液，以此混合标准溶液为起始溶液，用甲醇以1∶1的比例逐级稀释得到各个系列质量浓度的标准溶液（见表1）。另精密称取5.0 mg丙酸睾酮对照品，甲醇定容至10 mL，即得质量浓度为0.50 g／L的丙酸睾酮贮备液，用甲醇稀释100倍，即得质量浓度为5 mg／L的丙酸睾酮内标液。

表1 各对照品溶液的系列质量浓度

2.3.3 方法学考察

标准曲线制备：精密量取空白血清和皮肤样品，加入不同质量浓度2.2.2项下各标准溶液50 μL，内标溶液丙酸睾酮50 μL，按2.2项下方法进行处理并测定。以各对照品峰面积与内标物峰面积的比值（Y）为纵坐标、对照品质量浓度（X）为横坐标，用最小二乘法进行线性回归，分别得到血浆、脑组织和心脏组织中各丹参脂溶性成分的标准曲线。结果见表2。

准确度和精密度试验：按照精密度的测定方法，配制高中低3个质量浓度的对照品溶液，按生物样品处理方法制备，加入不同质量浓度的二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA，测定。结果见表3。

表2 血浆、大脑、心脏组织中4种药效成分的标准曲线及线性范围

专属性试验：按拟订色谱条件，测得血浆、脑组织和心脏组织中的内源性物质均不能干扰二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA和内标物的测定。以血浆为例，色谱图见图1。二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、内标丙酸睾酮和丹参酮ⅡA的保留时间tR分别为10.4，15.6，17.0，24.0，25.5 min，各被测成分峰与杂质峰分离良好。二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、内标丙酸睾酮和丹参酮ⅡA分离度均大于1.5。于244 nm检测波长下，脑匀浆液中的其他成分不影响二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅰ和内标丙酸睾酮的含量测定；于266 nm检测波长下，脑匀浆液中的其他成分不影响隐丹参酮和丹参酮ⅡA的含量测定；另外，按二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、内标丙酸睾酮和丹参酮ⅡA峰计理论板数均大于10 000。

萃取回收试验：分别制备低、中、高3个质量浓度的血浆、脑组织和心脏组织的标准溶液，按样品预处理和测定方法操作，得峰面积比与相应质量浓度对照品溶液进样测得的峰面积比进行比较，计算回收率，重复测定3次。由表4可知，血浆和脑组织匀浆液中各成分的萃取回收率均大于50%，RSD均小于15%；心脏组织匀浆液中各成分的萃取回收率相对较低，RSD均小于6%。表明萃取过程比较稳定，方法稳定性好，回收率较好。

2.3 丹参各脂溶性成分血药浓度和组织浓度分析

按2.2项下方法操作，得到冰片组血浆样品，可明显检测到隐丹参酮，而未加冰片组血浆样品中未检测到隐丹参酮；冰片组心脏组织样品中隐丹参酮的峰高明显比未加冰片组心脏组织样品中隐丹参酮的峰高要高。另外，两组的脑组织样品中均未检测到隐丹参酮，所有生物样品里均未检测到二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA。由于10个样本中隐丹参酮与内标物峰面积比值很小，不在线性范围以内，故无定量计算。色谱图见图2。可见，加入冰片后隐丹参酮峰高1.81，加入冰片后隐丹参酮峰高2.29，加入冰片后隐丹参酮峰高 1.22。

表3 血浆、大脑、心脏组织中4种药效成分精密度试验结果和方法回收率（n=3）

图1 血浆样品中丹参各脂溶性成分分析方法的专属性试验高效液相色谱图

表4 萃取回收试验结果（%，n=3）

3 讨论

3.1 给药方案选择

本试验采用灌胃，尝试了不同的给药方案，从最初灌胃大鼠人体等效给药剂量0.3 g／kg复方丹参片，到灌胃7.5 g／kg复方丹参片，均未检测到各被测组分；还尝试了多次给药，每8 h给药1次，连续给药8次，也未检测到各被测组分；考虑到各被测组分均为脂溶性成分，与油脂同服可能会增加药物的吸收，还尝试了灌胃给药复方丹参片混悬液后立即灌胃一定量的食用调和油，也未检测到各被测组分。0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶解丹参醇提物灌胃给药时，依然没有检测到各被测组分；乙醇-甘油-水（20∶20∶60）的混合溶剂溶解丹参醇提物灌胃给药时，未检测到各被测组分；最后，用1，2-丙二醇溶解丹参醇提物灌胃给药，也只能在血浆和心脏样品中检测到极微量的隐丹参酮。结果表明，二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA口服生物利用度较低，其溶解释放过程可能是影响吸收的限制因素，提示药剂工作者应从增加药物的溶解性着手，如将其制成固体分散片或β-环糊精包合物等剂型来提高其口服生物利用度，或者直接通过开发新的给药途径来研制相应的新剂型。

3.2 脂溶性成分血药浓度和组织浓度分析

通过分析冰片组和未加冰片组生物样品色谱图中隐丹参酮的峰高或峰面积，冰片组血浆和心脏组织样品中隐丹参酮的峰高明显比未加冰片组血浆和心脏组织样品要高，证实在血浆和心脏组织中冰片确实可促进隐丹参酮的吸收［12］。为研究隐丹参酮发挥扩张冠脉、增加冠脉血流量、防止心肌缺血和心肌梗死、改善微循环、保护心脏的药效物质基础提供了科学的依据。

3.3 丹参各成分在肾脏组织药物浓度分析

在丹参治疗骨质疏松研究［13-15］基础上，本研究中设计了测定肾脏组织中的药物浓度，进一步研究丹参脂溶性成分的代谢排泄情况及在治疗骨质疏松方面发挥的作用。但在建立肾脏样品中丹参各脂溶性成分含量测定的标准曲线试验过程中，发现拟采用的内标丙酸睾酮的峰面积很不稳定，所建立的标准曲线线性很差。分析原因，可能是甾体激素丙酸睾酮与肾脏组织匀浆液中的内源性成分有一定的相互作用，从而造成内标的萃取不完全。试验过程中也检测了部分肾脏样品，均未检测到被测组分，提示丹参脂溶性成分通过肾脏的排泄量会很少，丹参水溶性成分丹参素可发挥治疗骨质疏松［13］。

1.隐丹参酮 2.丙酸睾酮A.未加冰片组血浆样品 B.冰片组血浆样品 C.未加冰片组心脏样品 D.冰片组心脏样品

3.4 小结

丹参含有水溶性和脂溶性成分，以往研究中已证实丹参水溶性成分无法通过血脑屏障［14］。本研究中所有的丹参脂溶性成分在脑组织中均未检测到，实测药物浓度在分析方法的定量限以外，由于口服生物利用度低的原因，应提高灌胃丹参醇提物混悬液的量，或者更换给药方式选择注射给药［16］，以此优化试验方法来研究冰片丹参脂溶性成分的促吸收研究。