解脂耶氏酵母产脂肪酶的研究进展

张付涛，陈凯丽，王东月，刘雪莹，李运清*

（1.济宁医学院 临床医学院，山东 济宁 272067；2.济宁医学院 病原生物学教研室，山东 济宁 272067）

解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）是一种非常规酵母，在进化上与常规酵母——酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）相距较远，有其独特的生理生化及新陈代谢活性。近年来随着该物种基因组测序的完成，基因扩增系统的建立，越来越多的科学家开始了对解脂耶氏酵母的研究，并解决了众多的生物学问题。由于解脂耶氏酵母易培养，可利用的底物范围也非常广泛，使得该酵母在工业中的应用越来越广泛。本文主要对解脂耶氏酵母产生的脂肪酶的特点、脂肪酶编码基因及其产生的脂肪酶的应用等方面进行综述，让更多研究者了解到解脂耶氏酵母和脂肪酶基因的新进展以及为他们提供解脂耶氏酵母研究的新思路，同时为研究出更多提高脂肪酶活性和高效批量生产脂肪酶的新方法提供依据，进一步为解脂耶氏酵母脂肪酶的更多应用做铺垫。

1 解脂耶氏酵母与脂肪酶

解脂耶氏酵母是非传统的酵母物种之一，属于半子囊菌纲、耶氏酵母菌属。该酵母能利用多种疏水性底物为唯一碳源进行生长繁殖，并且可以利用众多廉价底物分泌产生多种代谢物，被美国食品药品监督管理局（food and drug administration，FDA）认定为一般认为安全（generallyregarded as safe，GRAS）的微生物。解脂耶氏酵母分布非常广泛，抗逆性极强，可以耐受高盐及低温，在海边油田等极端环境中均可分离得到[1-2]。随着基因组测序的完成，该酵母因其独特的生理生化、新陈代谢特点逐渐引起广大研究者的兴趣。

解脂耶氏酵母在富含脂质的培养基上可以形成明显的水解圈，这表明它可以分泌产生大量的脂肪酶，具有很强的分解脂肪的能力。脂肪酶能够逐步的将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸，归属于羧基酯水解酶类，存在于含有脂肪的动植物及微生物体内，如霉菌以及细菌等。本质为丝氨酸水解酶，具有多种催化能力，它能将三酰甘油酯分解为脂肪酸、二酰甘油脂、单酸甘油酯及甘油[3-4]。BRADY L等[5]通过X射线衍射法首次得到了脂肪酶的三维立体结构，它的活性中心是一个丝氨酸-组氨酸-天冬氨酸催化三连体。三连体活性中心位于脂肪酶内部，相对疏水的氨基酸残基形成一个螺旋状的“盖子”将其覆盖，当脂肪酶起活化作用时，这个“盖子”就会打开，此时活性中心就可以与底物结合，催化水解反应[6]。脂肪酶可以在水油界面上起催化作用，其天然底物一般是不溶于水的长链脂肪酸酰基酯。由于解脂耶氏酵母来源广泛，容易获得并且无毒、无污染，因此，在脂肪酶的高效生产中逐渐被广泛应用。

2 解脂耶氏酵母中脂肪酶相关基因

近年来，对解脂耶氏酵母中脂肪酶相关基因的研究主要集中在基因LIP2、LIP7和LIP8，其中基因LIP2被研究的最为广泛。解脂耶氏酵母中发现最早的脂肪酶相关基因是LIP2，该基因编码的蛋白含有334个氨基酸，可以分泌到胞外，是一种胞外酶，比较容易纯化获得。研究发现，LIP2基因缺失后，解脂耶氏酵母仍能在以甘油三酯为唯一碳源的培养基中生长，表明LIP2基因缺失后还存在其他酯解途径[7-9]。在与解脂耶氏酵母亲缘关系较近的念珠菌属酵母Candida deformans中，BIGEY F等[10]通过基因互补实验，确定了CdLIP1、CdLIP2和CdLIP3均为脂肪酶相关基因，其中CdLIP1和LIP2同源性较高，为91.6%。FICHERSP等[11]利用基因CdLIP2和CdLIP3设计特定脂肪酶相关引物，在解脂耶氏酵母中扩增得到了LIP7和LIP8，它们分别编码366和371个氨基酸，编码产生的酶不能分泌到细胞外，磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffersaline，PBS）清洗后容易释放，为细胞壁结合酶。同时缺失了LIP2、LIP7和LIP8三个脂肪酶基因的突变体酵母仍然可以在三油酸甘油酯和丁酸甘油酯为唯一碳源的培养基上缓慢生长，但此时检测不到胞外脂肪酶，这说明仍然存在其他脂肪酶基因或其他酯解途径参与分解脂类化合物，但这些酶类不能被分泌到胞外。

3 脂肪酶的活性研究

脂肪酶（lipase，EC 3.1.1.3）具有多种催化能力，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、转酯化、醇解等逆向合成反应。脂肪酶来源不同其催化特点和效率也不一样，其中比较有意义的脂肪酶是一种用于有机相合成的具有转酯化功能的脂肪酶，它对于合成精细化学品有很大的帮助[12]。

解脂耶氏酵母分泌产生的脂肪酶Lip2作为一种具有较高应用价值的脂肪酶具有产量高、易纯化的优点，但该酶热稳定性较差，阻碍了其在工业上的广泛应用。林霞[13]尝试通过点突变技术进一步提高Lip2的热稳定性。成功构建脂肪酶Lip2三个突变子T117G/C244A、F237C/C244A、T117G/F237C/C244A，并在毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115中成功表达。最终突变酶T117G/F237C/C244A的热稳定性最佳，在50℃条件下的半衰期＞100 min，是前期改造的Lip2突变酶（14.4 min）的热稳定性的7倍。由于在野生型解脂耶氏酵母中产生的脂肪酶活性较低，许多学者尝试在其他微生物上表达该基因，以提高脂肪酶的产率。例如用α-凝集素、α-凝集素、絮凝集素Flolp等表面展示蛋白以及优化密码子等方式，使脂肪酶基因LIP2、LIP7、LIP8在酿酒酵母、毕赤酵母中高活性表达，以达到大量生产脂肪酶的目的[14-17]。

另外，脂肪酶的活性也受到底物类型和温度、酸碱度等不同理化性质的影响。FICKERS P等[11]研究发现，脂肪酶Lip7和Lip8的最适底物分别为己酸（C6）和癸酸（C10），发酵的最适温度分别为40℃和45℃，最适pH值均为8.0。ZHAO HY等[18]利用毕赤酵母成功表达Lip4、Lip5脂肪酶，获知Lip4与Lip5的最适底物均为癸酸对硝基苯酚酯，并且这两种酶都偏好于水解中短链对硝基苯酚酯，最适pH值为7.0，最适温度为40℃，二者均属于常温中性脂肪酶，其中脂肪酶Lip4对pH和温度更敏感。Lip4和Lip5均能被Ca2+激活，Lip5还能被Mg2+激活；Hg2+、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）可以强烈抑制这两种酶的活性。

超高压技术也叫超高压杀菌技术，是指利用100～1 000 MPa的压力，在常温或温和条件下对食品加压，以压力作为能量因子从而影响细胞形态，改变细胞膜通透性，抑制酶的活性，造成蛋白质不可逆变性[19]。起初超高压技术主要用于食品保藏，后来NOEL M等[20]研究发现，超高压可以提高脂肪酶活性。杨新颖等[21]研究发现，在超高压作用下，解脂耶氏酵母脂肪酶的活性有所提高。

4 脂肪酶的生产研究

脂肪酶是一种具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些酯类的水解、醇解、酯类交换和逆向合成反应等，广泛应用于酪成熟、废物处理、药物合成以及人类疗法等。该酶广泛存在于动植物和微生物中。植物脂肪酶存在于能量储备的组织中，例如油料作物种子。动物体内胰脏和脂肪组织中脂肪酶含量比较多，相关研究证明在微生物中脂肪酶含量更加丰富[22-24]。

目前工业上生产脂肪酶多采用发酵法，但对提高解脂耶氏酵母脂肪酶产量的发酵过程和培养方法研究的很少。张小琴等[25]探索了解脂耶氏酵母W29生产脂肪酶的发酵条件，分别对发酵温度、培养基起始pH值、摇床转速以及发酵时间等进行了探索，研究发现产脂肪酶的最佳条件：发酵温度30℃，起始pH7.0，摇床转速150 r/min，接种量2.5%，培养时间60 h，培养基中橄榄油含量7.0 g/L。在此条件下，生产的脂肪酶酶活最高，可以达到7.7 U/mL。

由于脂肪酶生产成本较高，因此限制了其在工业中的广泛应用，而高效低成本的脂肪酶的需求迫在眉睫。张黎等[26]以解脂耶氏酵母为出发菌株，利用基因扩增技术，首次实现了脂肪酶基因LIP1在巴斯德毕赤酵母中的功能性表达，使脂肪酶的基因资源进一步得到延伸，又通过重叠延伸聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术，促进了基因LIP1的高效表达。同时也构建了GAP强启动子的组成型表达载体PGAP9K，成功的使脂肪酶Lip1分泌到胞外。通过对原始密码子基因LIP1以及密码子优化后的基因mlip1构建重组质粒，发现密码子优化可使脂肪酶表达水平大大提高，从而进一步提高了脂肪酶的表达量。遗憾的是，目前尚未有采用解脂耶氏酵母进行批量生产脂肪酶的报道，但相信随着科学研究的进行，解脂耶氏酵母可能会成为生产脂肪酶的主力军。

5 解脂耶氏酵母脂肪酶的应用研究

解脂耶氏酵母脂肪酶可以利用众多廉价底物并且可以产生很多有工业应用价值的代谢底物。本部分仅从以下四方面阐述该酵母生产的脂肪酶的应用现状。

5.1 脂肪酶在环境治理中的作用

随着社会各个方面快速发展，对石油需求日益增多，每年产生的石油污染物也迅速增加，油脂废水中的高油脂含量、高化学需氧量（chemical oxygen demand，COD）和生化需氧量（biochemical oxygen demand，BOD）引发很大的环境问题，极大的威胁人类的安全。而现在处理油脂废水采用的方法主要有物理法、化学法和生物法，由于物理法和化学法周期长、成本高而且可能造成二次污染，故不常用。相比较而言生物法处理效率高、成本低、占地少、不需特殊设备等优点用来处理油脂废水更为合适。而生物法中又以解脂耶氏酵母最有优势，因为解脂耶氏酵母能够分泌多种脂肪酶且它能在油脂废水中存活很长时间。脂肪酶不仅可以有效处理油脂加工过程中所产生的含脂废物，还可以处理石油开采和和炼制过程中产生的石油泄漏。因此可以直接在活性污垢中进行油脂废水的处理，但直接应用脂肪酶使油脂废水处理效果不佳。如果能在水油脂双相体系中添加一种有机溶剂，这种溶剂既能够很好的溶解脂肪酸和油脂，还对酶稳定性影响很小，则在脂肪酶催化油脂水解的过程中可以大大的提高油脂水解度。唐静[27]通过一种新型技术得到了一种全细胞脂肪酶，他们主要是通过克隆高效降解脂肪酶基因，将高水解活性脂肪酶表达在解脂耶氏酵母细胞表面而获得，这种脂肪酶不仅有效提高了污水中油脂和COD的去除率，还降低了成本，减少了工艺流程。该脂肪酶全细胞酶剂还可以用于土壤污染的恢复。

5.2 脂肪酶在食品工业中的应用

二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）俗称脑黄金，属于ω-3不饱和脂肪酸家族中的重要成员，对人体非常重要，既可以降低血液中三酸甘油酯和胆固醇的含量，预防血栓形成，还可以抑制发炎，调节免疫与防治癌症等[28-29]。DHA还可以减少产后抑郁与改善老年痴呆，促进胎儿大脑发育。人体需要摄入一些含有DHA的食物或者保健品来满足人类的健康需求。要想获得更优质的DHA就必须开发更好的生产方式，而解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2，是水解鱼油富集DHA的理想催化剂之一。但是由于耐受性差，易溶于水，不易与产物分离，价格昂贵而且不能回收利用等缺陷严重影响了解脂耶氏酵母中脂肪酶Lip2的广泛应用，张晓焰[30]通过固定化工艺对游离酶进行了改造。通过一系列固定化工艺，并对固定化脂肪酶Lip2与游离脂肪酶Lip2的酶学性质进行考察发现，固定化的脂肪酶Lip2的pH稳定性与热稳定性比游离态有了显著的提高，而且操作温度性更好，生产成本进一步降低，效率进一步提高。

5.3 脂肪酶在生物柴油中的应用

生物柴油是利用可产生油料的动物植物以及微生物等为原料，通过催化反应合成柴油燃料。常用的催化剂分为酸、碱和酶。与酸和碱相比，脂肪酶催化的生产工艺更简单，条件更温和以及对材料要求更低而且还无污染[31-32]。但脂肪酶的成本太高导致了利用酶法进行商业化生产受到了限制。刘文山[33]开发了脂肪酶表面展示技术。展示的宿主包括噬菌体、细菌和酵母等。展示的脂肪酶与自由酶相比热稳定性更强，有机溶剂更稳定。这种技术是将酶固定在细胞表面，从而让底物更容易进入，同时得到产物也更加方便。该研究为酶法制备生物柴油的广泛应用奠定了理论基础。

5.4 脂肪酶在家禽养殖业中的应用

王耀锋[34]成功构建一种新型解脂耶氏酵母脂肪酶，这种脂肪酶的最适温度和最适pH与肉鸡体内生理环境的适应性最良好，而且在较低pH下，稳定性也比较好，因此，在饲料工业中可以广泛的被应用。这种脂肪酶在添加了适宜保护剂后获得了具有较高稳定性的脂肪酶制剂，将该脂肪酶制剂应用到动物试验中，将解脂耶氏酵母脂肪酶添加到肉鸡的饲料中，提高了饲料油脂利用率，并对肉鸡生长性能、脂质代谢和安全性进行了全面评估。结果显示，单独添加酵母菌和脂肪酶以及混合添加酵母菌和脂肪酶的5组与对照组相比，屠宰率、全净膛率、胸肌率、腿肌率、腹脂率、内脏指数、空肠长度指数均无显著差异，展现了良好的饲用安全性。

6 展望

解脂耶氏酵母脂肪酶在食品化工等各个方面具有很高的应用潜力，它在食品生产、柴油制备、废物处理等方面具有独特的优势，而且在食品工业生产中产生的很多废弃物可以被脂肪酶当做底物来生产多种产品。但是目前对于脂肪酶的工业化生产和大规模应用还有许多关键环节受到制约，所以实现脂肪酶的批量生产及寻找影响其发挥最大效能的因素还有待探究。另外，在微观层面上，对脂肪酶Lip2、Lip7、Lip8等的研究相对较多，但是其他脂肪酶研究则较少，这也是限制脂肪酶广泛应用的一个原因，更多的研究有待进一步的开展。