同源样本一致性分析的审评要求

付文竹 陈静 广东省药品监督管理局审评认证中心 （广东 广州 510080）

内容提要： 从样本类型、添加剂种类、样本要求、一致性评价几个方面对同源样本类型的适用性进行讨论，以期给体外诊断试剂企业注册申报及审评过程提供一些建议。

在体外诊断试剂注册及审评时，往往会遇到产品适用不同样本类型，如血清、血浆，全血、尿液等。其中尿液属于非同源样本，在进行性能评估和临床试验时都应单独评估，而血清、血浆属于同源样本类型，根据《免于进行临床试验的体外诊断试剂的临床评价资料基本要求（试行）》[1]：对于具有同源性的不同样本类型，如血清、血浆或全血样本，可在分析性能评估中对样本适用性进行研究，或在临床评价中对每种样本类型分别进行符合统计学意义数量的评估。因此，样本的适用性研究应该系统科学的评估，而目前试剂生产商在做样本适用性评估时多流于形式，评价不充分。本文将系统梳理在同源样本类型的适用性研究过程中需关注的问题。

1.样本类型及添加剂的选择

临床检验中有时要使用全血、血浆、血清，而目前存在的问题一是把血浆、血清、全血的检测结果视为等同，二是忽略了不同抗凝剂导致的某些项目结果差异。样本类型根据具体检测的项目往往会有一个最适样本类型，有些检测项目推荐使用血清样本，有些项目血浆检测更接近身体真实状态，有些血清、血浆样本均可使用，有些不同样本类型检测结果确实存在差异，特别是免疫类项目，其中全血样本往往因为血细胞压积对检测产生较大影响，并因方法学的不同，影响也不同，免疫层析法的影响低于液相法。抗凝剂是抑制血液凝集的添加剂，它保证血样中待测成分在进行分析前无明显改变。目前对于抗凝剂的添加，实验室应该参照《实验室检查中抗凝剂的使用》合理选择抗凝剂，某种抗凝剂对某成分的检测会产生明显干扰现象，则应该避免使用该抗凝剂，对于可以选用不同抗凝剂测定的物质则应该注意它们对实验结果的影响，并通过科学实验进行结果比对，比较不同标本类型之间的差异。在选择合适的抗凝剂后，还要合理控制血液和抗凝剂的比例。比例过高或过低都会影响样本的质量，血液比例高时，由于抗凝剂相对不足，血浆中出现微凝血块的可能性增加；微凝血块可能堵塞检验仪器，影响检验质量；血液比例过低，抗凝剂相对过剩，对很多检验造成严重影响，如血液和0.129mol/L柠檬酸钠比例由9:1降至7:1时，APTT结果会显著延长[2]。因此在选择抗凝剂种类时，还应对抗凝剂的添加量进行评估，选择最适比例，并应在说明书中明确出来，以供临床单位根据需要采用合适的采血管。

除了抗凝剂之外，对于促凝剂、分离胶的添加实验室较少关注，而在实际临床检验过程中促凝剂、分离胶的添加导致采血管的不同，目前常用的血清收集采血管主要有无添加剂管、惰性分离胶促凝管和促凝管；血浆收集采血管主要有肝素锂抗凝管、肝素钠抗凝管、EDTA-K2抗凝管和EDTA-K3抗凝管。各个厂家生产的各类促凝管使用的促凝剂不尽相同，大多使用具有理化性质的物质作为促凝剂，如硅石粉、玻璃粉、硅碳素等，经特殊加工制成粉剂用定量喷雾器均匀喷涂在真空采血管内壁上，达到快速促凝的目的。不同种类的促凝剂有各自的优缺点，且其品种、性能、浓度直接影响血样的性状和检测结果。因此，除确认适用样本类型外，促凝剂、分离胶等对样本的影响也应如抗凝剂作为试剂开发厂家充分研究的考虑因素，即对采血管的类型进行确认[3]。

2.样本要求

2.1 样本的采集及保存

在进行同源样本比对时，只有注重了同源性才具有可比性，即所比样本应为同一提供者来源，对所使用的不同样本类型、不同采血管进行一针多管静脉采血，如不能立即测定时，应规定每种样本类型的保存方式、保存条件，并严格按照要求进行保存。

2.2 样本处理

临床上用来检测的同源样本类型主要有血清、血浆、全血。血清、血浆与全血之间的差异主要是由凝血过程产生的，这决定了3种血液标本的实验室检查中不同的适用范围和处理方法。血清和血浆均是不含细胞（包括血小板）等有形成分的血液液体部分，其主要区别是血清不含凝血因子和血小板，血浆则含有凝血因子。卫生行业标准WS/T225-2002《临床化学检验血液标本的收集与处理》中，推荐采血后应置于室温30～60min让其自行凝固，离心制备血清；血浆标本要求采血后将血液注入含有相应抗凝剂的试管中，立即混匀，混匀后可立即离心分离血浆。血清/血浆通常用（1000～1100）×g，离心10min制备[4]。对于真空采血管，尤其是血清分离胶促凝采血管，由于管内添加有分离胶和促凝剂，大大缩短了血液凝固时间，其离心条件也十分关键。试剂开发商在进行样本一致性研究时，应在分析性能评估中，评估样本的离心速度、离心时间，同时建议在说明书中的样本要求中明确。

3.统计分析

在确定一个物质是否存在干扰前，评价者首先必须确定所得到的结果有统计学意义。有统计学意义的样本例数是必要的，这样才能保证试验中有足够的检验效能能检出有临床意义的干扰，样本量过小，无论试验结果是否存在差异，都有可能因为随机误差过大而无法得到正确的结论。近些年来，国家局发布了一系列的指导原则，在指导原则中关于样本适用性分析中，多数要求“如产品声称的样本类型包括血清、血浆或全血样本，则应对三者进行相关性研究以确认三者检测结果是否完全一致或存在某种相关性（如系数关系）[5]。”然而在审评过程中，发现部分试剂生产厂商在对样本适用性分析时，仅仅做了线性相关分析，给出r值或r2值，未进一步分析一致性，而相关系数是用于表示两定量资料线性相关关系的密切程度，非一致性。一致性分析可采用配对检验、方差分析、Bland-Altman法等对多种样本类型的数据进行差异性分析，如无统计学差异且无临床意义，则认为样本具有相同的适用性，如有差异，可尝试进一步分析数据，是否具有恒定的偏差，即通过一定的补偿系数来修正结果，使不同样本之间的检测结果具有可比性，多见于全血样本。如差异既有统计学意义又有临床意义，则认为样本不具相同的适用性。

4.小结

随着真空采血管在临床实验室的广泛应用，试剂生产厂家在进行样本适用性研究时，首先除了要考虑同源样本类型的一致性，还应充分考虑临床实际应用中所用不同采血管造成的样本检测一致性问题，而添加剂又是决定真空采血管性能至关重要的因素[6]。添加剂有抗凝剂、促凝剂和分离胶，不但要关注抗凝剂对样本的影响，同样应关注促凝剂、分离胶及实际临床应用的不同采血管对样本的影响。其次进行样本比对时，应选择合适的统计方法进行验证样本之间、不同采血管之间等所有适用样本类型及条件的一致性，除了给出线性相关系数外，更应进一步对差异及一致性进行充分验证。本文针对样本适用性在审评过程中遇到的一些问题的以上总结，希望对企业和审评员在研究和审评过程中有所帮助。