HO-1介导黄芪甲苷抗原代心肌细胞缺氧/复氧损伤作用研究*

杨 萍 ，周玉平，夏 晴 ，姚立鹏 ，李高文，常秀春 ，王 凤

（1．宁波卫生职业技术学院护理学院，宁波 315100；2．宁波大学医学院附属医院，宁波 315020）

心肌缺氧/复氧（H/R）损伤是心肌缺血再灌注治疗后面临的治疗难题，炎症因子释放是H/R发生的重要因素[1]。血红素氧化酶-1（HO-1）是近年来发现的组织保护酶，已被证实具有抑制炎症等多种细胞保护功能[2]。黄芪广泛应用于心血管疾病的治疗，其主要药理活性成分黄芪甲苷（AS-Ⅳ），对多种心肌细胞损伤模型具有显著的保护作用，且作用机制主要与抗氧化、抗炎作用有关[3-5]，但具体的靶向分子及信号通路尚不十分明确。由于HO-1是最近发现的内源性抗氧化酶，已有的研究表明其具有心肌细胞保护作用[6]。HO-1是否介导了AS-Ⅳ对H/R损伤心肌的保护作用值得研究。鉴于HO-1与AS-Ⅳ在细胞保护方面存在交集，HO-1可能介导了黄芪甲苷对H/R心肌损伤的保护作用。本研究分别以AS-Ⅳ、HO-1激动剂原卟啉氯化钴（CoPP）、HO-1拮抗剂原卟啉Ⅸ锌（Ⅱ）络合物（ZnPP）对H/R损伤的心肌细胞进行干预，解析AS-Ⅳ的心肌保护作用与HO-1之间的关系，为阐释AS-Ⅳ抗心肌缺血再灌注损伤提供理论依据。

1 材料

1.1 动物 SD大鼠乳鼠，SPF级，出生1～3 d，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号SCXK（京）2016-0011。

1.2 药物与试剂 AS-Ⅳ（成都瑞芬思生物科技有限公司，批号：170614，纯度≥99%）；HO-1激动剂CoPP、HO-1 拮抗剂 ZnPP、四甲基噻唑蓝（MTT，美国Sigma公司）；DMEM高糖培养基、胎牛血清、胰蛋白酶（美国GIBCO公司）；兔抗小鼠GAPDH多克隆抗体、兔抗小鼠HO-1多克隆抗体（Santa Cruz公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒、超敏电致化学发光（ECL）试剂盒（上海碧云天生物工程有限公司）；乳酸脱氢酶（LDH）、心肌肌钙蛋白（cTnT）、超敏 C 反应蛋白（hs-CRP）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。其他试剂均为国产分析纯。

1.3 仪器 生物洁净工作台（苏州安泰空气有限公司）、恒温二氧化碳培养箱（美国Thermo公司）、倒置荧光显微镜（日本Olympus公司）、多功能酶标仪（美国Bio-Tek公司）、全自动生化分析仪（日本Hitachi公司）、逆转录反应Cycler PCR仪（美国Bio-Rad公司）、PCR扩增仪（美国Life technology公司）。

2 方法

2.1 心肌细胞原代培养 参考文献[7]方法进行心肌细胞原代培养：取出生1～3 d SD大鼠乳鼠，胰酶消化法将心肌组织逐步分离成单个心肌细胞，接种至培养瓶，置于37℃，5%CO2饱和湿度的孵箱中培养，差速贴壁去除成纤维细胞。调整纯化后的心肌细胞浓度，接种至6孔板或96孔板中，每24 h更换1次培养液。72 h后细胞基本融合时用于实验。培养的心肌细胞经α-横纹肌肌动蛋白单克隆抗体的免疫细胞化学鉴定，原代培养乳鼠心肌细胞纯度达95%以上。

2.2 H/R损伤模型的复制 参照文献[8]并加以改进建立心肌细胞H/R模型。心肌细胞置于缺氧装置中以模拟缺血溶液培养4 h后，再于常氧环境中换用模拟再灌注溶液培养4 h，即为H/R模型。

2.3 细胞分组 心肌细胞悬液调整浓度后，随机分为以下5组：正常对照组、H/R组、AS-Ⅳ组（H/R造模后给予AS-Ⅳ100μmol/L干预24h）、CoPP组（H/R造模后给予终浓度为20 μmol/L CoPP干预24 h）、ZnPP组（H/R造模后给予终浓度为20 μmol/L ZnPP干预24 h）。每个组设置6个复孔，实验重复2次。

2.4 MTT检测细胞活力 按实验分组给予相应的处理因素后弃去上清液，每孔加入终浓度为0．5 mg/L MTT 溶液 100 μL，继续孵育 4 h后，每孔加入 150 μL二甲基亚砜（DMSO），震荡10 min，使用酶标仪在490 nm处检测其吸光度值。

2.5 LDH、cTnT含量的测定 细胞分组处理后，取细胞培养液，按试剂盒操作说明检测LDH、cTnT含量。

2.6 hs-CRP、TNF-α含量的测定 细胞分组处理后，取培养液，按试剂盒操作说明检测细胞上清液中 hs-CRP、TNF-α 含量。

2.7 蛋白免疫印迹（Western blot）法检测 HO-1蛋白表达 细胞分组处理后，收集细胞并提取总蛋白。取样品蛋白质50 μg，与SDS上样缓冲液混合，95℃～100℃变性5 min。制胶，上样，电泳，切胶，半干转膜器恒压12 V转PVDF膜60 min，磷酸盐吐温缓冲液（PBST）洗膜 10 min×3次，以 5%牛血清白蛋白（BSA）/磷酸缓冲盐溶液（PBS）封闭1 h，加入一抗中4℃轻摇孵育过夜，PBST洗膜10 min×3次，加入二抗室温轻摇孵育1 h，将膜置于Kodak Image Station 2000MM成像系统曝光，获取目的条带图像。Image J软件分析灰度值，以GAPDH为内参，计算HO-1蛋白相对表达量。

2.8 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）测定HO-1mRNA表达 按实验分组给予相应的处理后，提取心肌细胞总RNA，反转录合成cDNA。采用SYBR两步法进行PCR扩增。HO-1引物：上游5'-GCTCTATCGTGCTCGCATGA-3'，下游 5'-AATTCCCACTGCCA2CGGTC-3'。GAPDH引物：上游5'-CCTCGTCTCATAGACAAGATGGT-3'，下游 5'-GGGTAGAGTCATACTGGAACATG-3'。PCR反应条件为：95℃2 min，95℃变性15 s，60℃延伸退火1 min，40个循环。

2.9 统计学方法 数据采用SPSS 20．0统计软件进行分析。数据使用均数±标准差（s）表示。采用单因素方差one-way ANOVA进行方差分析，方差齐时采用LSD法进行组间多重比较，方差不齐时采用Dunnett's T3法进行组间多重比较。P＜0．05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 各组心肌细胞活力比较 MTT结果显示，与正常对照组比较，H/R组心肌细胞活力显著下降（P＜0．05）；与 H/R 组比较，HO-1抑制剂 ZnPP 组细胞活力显著降低（P＜0．05），HO-1 激动剂 CoPP 组则显著升高（P＜0．05），说明增加 HO-1可减轻 H/R 诱导的细胞损伤。与H/R组比较，AS-Ⅳ组细胞活力显著增加（P＜0．05），具有类似 HO-1激动剂样作用。结果见图1。

图1 各组的细胞活力Fig.1 Cardiomyocytes viability in each group

3.2 各组细胞上清LDH、cTnT含量比较 与正常对照组比较，H/R组细胞上清LDH、cTnT含量显著增加（P＜0．01）；ZnPP 则显著加重 H/R 导致的上述指标变化；与H/R组比较，CoPP组心肌细胞LDH、cTnT 含量显著降低（P＜0．01），说明 HO-1可减轻 H/R导致的细胞损伤。与H/R组比较，AS-Ⅳ可显著降低H/R预处理后的LDH、cTnT含量，说明AS-Ⅳ具有类似HO-1激动剂样作用。结果见图2。

图2 各组LDH和cTnT表达的水平Fig.2 Levels of LDH and cTnT in each group

3.3 各组细胞上清hs-CRP、TNF-α水平比较 与正常对照组比较，H/R组细胞上清炎症因子hs-CRP、TNF-α 表达显著升高（P＜0．01）；与 H/R 比较，CoPP组hs-CRP、TNF-α表达水平显著降低（P＜0．01），说明HO-1激动剂可减轻H/R导致的炎症损伤。与H/R比较，AS-Ⅳ可显著降低hs-CRP、TNF-α表达水平，说明AS-Ⅳ具有类似HO-1激动剂样作用。结果见图3。

图3 各组hs-CRP、TNF-α表达的水平Fig.3 Levels of hs-CRP and TNF-α in each group

3.4 各组细胞HO-1mRNA、蛋白表达比较 PCR及Western blot结果显示，与正常对照组比较，H/R组 HO-1 mRNA 及蛋白表达均显著升高（P＜0．01）；与H/R比较，CoPP组HO-1 mRNA及蛋白表达水平均进一步升高（P＜0．01），ZnPP 组则显著下降（P＜0．01）。与 H/R 比较，AS-Ⅳ组 HO-1 mRNA 及蛋白表达水平均显著升高（P＜0．01），具有 HO-1 激动剂CoPP样作用。结果见图4。

图4 各组AS-Ⅳ、CoPP及ZnPP对缺氧/复氧预处理后HO-1 mRNA及蛋白表达水平的影响Fig.4 Effects of the mRNA and protein expression levels of HO-1 after H/R intervention by AS-Ⅳ,CoPP and ZnPP in each group

4 讨论

HO-1是一种应激反应蛋白，近年来被公认为是一种重要组织保护酶[2]，如药物诱导HO-1表达增加可减轻脂多糖（LPS）诱导的肺动脉平滑肌细胞损伤[7]。HO-1对多种心肌损伤模型具有保护作用，其机制包括增加一氧化碳（CO）水平，调节内皮型一氧化氮（eNOS）、核转录因子-κB（NF-κB）活性，TNF-α、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）水平，减少斑块炎症反应和细胞凋亡[8-9]。研究结果表明HO-1对心肌细胞H/R损伤具有保护作用，其机制与抑制炎症因子表达有关。因此，HO-1是治疗心肌缺血再灌注损伤一个很好的干预靶点，通过各种方式诱导HO-1表达必然在细胞保护方面发挥重要作用。

根据患者的临床特征，中医学者认为心肌缺血再灌注损伤的病机以心气虚衰为本，故中医治则当益气扶正以固本[10]。黄芪有健脾补中、补气固表、升阳举陷等功效，成为中医临床最常用的补气扶正中药。AS-Ⅳ是黄芪药理活性的主要物质之一。实验研究证实AS-Ⅳ对多种心肌细胞损伤模型具有显著的保护作用，具有增强心肌收缩力、改善心肌能量代谢、抑制心肌纤维化和心肌细胞凋亡作用[3]。本研究通过HO-1激动剂CoPP、HO-1抑制剂ZnPP分别干预H/R损伤心肌细胞，验证了HO-1通过抑制炎症因子表达对心肌细胞损伤发挥保护作用，进一步证实了AS-Ⅳ对H/R损伤的心肌细胞具有保护作用，其机制与诱导具有保护作用的HO-1表达有关，为阐释AS-Ⅳ抗心肌缺血再灌注损伤提供了理论依据。