手工制作组织芯片的方法

朱伟峰 彭凤英 翁秀琴 蔡晓雯

组织芯片（Tissue Chips）是把数十个至数百个患者的组织整齐有序的排列到同一个蜡块上，进而制成组织切片用于HE、组化染色、DNA和RNA检测分析等[1]。1998年Kononen等首次提出组织芯片的概念并证实组织芯片的实用价值[2]。从此组织芯片得到飞速发展，它最大的作用是将基因、蛋白水平的研究与组织形态学相结合，应用同一实验条件同时研究大量不同患者组织样本（高通量），减少实验误差，使实验结果更可靠，极大地提高实验效率，并节约实验成本和人力[3-5]。但组织芯片技术一般采用进口的组织微阵列仪或组织芯片制作仪，价格高，不适于基层[6]。本文通过临床经验及设计，介绍一种建议组织芯片制作方法，操作简单，效果满意，适用性广泛，以供临床参考。

1 材料与方法

1.1 标本来源

收集2015年12月—2017年12月福建省肿瘤医院病理科60例肺癌患者病例制作组织标本。

1.2 仪器设备

石蜡（德国 Leica，Histowax），组织芯片仪（Quick-Ray 韩国UNITMA），Thermo切片机（HM325），隔水式培养箱（上海一恒科学仪器有限公司，型号为GHP9180），一次性刀片（Leica），Leica摊片机（型号为HI 1210）和Leica烤片机（型号为HI 1220），Thermo包埋机（HISTOSTAR）。

1.3 方法

1.3.1 组织处理 所有标本均经4%中性缓冲福尔马林固定，取材，脱水，包埋，切片和HE染色。

1.3.2 组织芯片制作过程 （1）空白蜡块制作：把高熔点的蜡（58～60℃）制成空白蜡块；（2）软化：把空白蜡块倒扣在烤片板上软化石蜡；（3）组织芯片设计：根据患者例数及空白蜡块用记号笔设置位点，选择手工芯片仪直径2 mm的取样头；（4）打孔：将取样头在软化空白蜡块上穿孔；（5）取样：病理医师HE镜下选取代表性区域并用记号笔标记并与对应蜡块进行取样定位并倒扣在60℃烤片板，用组织芯片抢取样并按照芯片阵列设计图打入对应的软化蜡块孔，依次将所有样本植入芯片蜡块；（6）移除加样好的芯片蜡块使之硬化收缩并抹平使各个组织尽量在同一平面，用刀片使组织芯片与包埋盒分离；（7）二次包埋：在60℃温箱用低熔点的蜡（56℃）把组织芯片放包埋框，观察到芯片蜡块达到相应的溶解状态时重新包埋，放入冰盘或冷冻台冷却；（8）蜡块储存：蜡块冷却后使之与包埋框分离，除去蜡块四周蜡边备用。

1.3.3 组织芯片切片 组织芯片切片步骤：（1）组织芯片蜡块放4℃冰箱预冷保证芯片温度一致，有利于切片；（2）取出固定于切片头，认真耐心的调试切片刀和蜡块面的角度，减少修片造成的组织损伤，尽量选用锋利的一次性刀片，然后做3μm厚的连续切片；（3）低浓度酒精漂片；（4）48℃水浴展片；（5）防脱带胶片捞片；（6）风干、60℃烤片板烤片30 min后常温备用。

2 结果

制备的组织芯片各个组织为所要组织形态学区域，蜡块完整，组织排列整齐，蜡块未见开裂及组织丢失，组织与蜡块结合紧密，组织芯片能被完整切出。

3 讨论

组织芯片与传统石蜡切片相比，组织芯片在实验结果的可靠性、科学性、可比性上都具有优越性[7]。同样我们也可以将芯片用于制作免疫组化对照用的“套餐式”芯片[8]，Low等[9]报道了一种“香肠”组织包埋法，费时、费力且耗材，随后经过多次改良也制成多组织阳性对照片，用于免疫组化染色。通过组织芯片的制作过程我们应认识并了解它在实验室的重要地位，不断发展组织芯片技术。

本实验方法简单易行，受体蜡块也是自己制备，几乎不需要任何费用，制作组织芯片涉及较多的蜡块和切片，制作步骤较多，因此，其操作过程要求细致精准，否则组织芯片的完整性就难以保证。通过在组织芯片的制作过程中，总结以下几点注意事项：（1）患者标本的选取：一定要把蜡块和相应的HE对应清楚，因为标本存放时间长，可能收缩变形导致HE上标记的位点和蜡块对应的位置有误差[10]，可能导致取到无效组织，所以尽量选取组织丰富区域（一般都是诊断医生定位）；（2）受体蜡块制备严格按照组织阵列设计图操作，避免错样、漏样；（3）制作受体蜡块烤片板预热使蜡软化便于穿孔，防止蜡开裂[11]；（4）钻头在使用前用电吹风或放温箱预热，再放入二甲苯或松节油浸泡除去残留蜡；（5）芯片抹平很重要，可以保证组织因为切面不平展而导致切片损伤组织，可以在组织全部打入孔后反过来把切面在试验台上压实抹平；（6）包埋石蜡与受体石蜡熔点接近，这样更有利于石蜡的融合，也会有利于切片；（7）由于组织芯片包含各种各样或者时间长短不一的组织，而组织的质地和软硬都不尽相同，所以尽量用锋利的刀片切片，这样也比较不易出现刀痕皱褶[12]；（8）组织芯片在切片时调整切片切面要求严格，前期角度调整后可减少组织较薄位点的损失；（9）组织芯片要切片完整、美观、厚薄均匀、无刀痕皱褶，这对操作人员的技术水平有极高的要求，一块组织芯片的组织数量越多，它的制作难度就越大。

总之，组织芯片的实用性很高，它的制作是一项经济高效的技术。操作人员要通过细心了解，耐心安排，专心的操作，尽量保证组织芯片的制作质量。