库蠓核糖体DNA内转录间隔区1序列的测定与分析

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库蠓(CulicoidesLatreille)俗称“墨蚊”、“小咬”，隶属于昆虫纲(insecta)、双翅目(diptera)、蠓科(ceratopogonidae)，全世界现有1 368种、中国已知348种[1-2]，是引起野生和家养反刍动物流行病的重要媒介昆虫，其通过刺吸动物血液来传播蓝舌病(BT)、家畜流行病出血热(EHD)、非洲马瘟病(AHS)等诸多动物传染病[3]。上述疾病的病原通过媒介库蠓和易感宿主之间的一系列复制循环而持续存活于自然界中[4]，因而其易于引发医疗卫生和兽医等领域的家畜流行病，从而造成牛、羊等养殖业的巨大经济损失，欧洲曾发生过蓝舌病大流行[5-6]，国内云南、广西、新疆和内蒙古等29个省也曾先后在牛羊血液中检测出蓝舌病病毒(BTV)[7]。目前，BT和AHS已被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病[8]，中国也将BT列为一类动物疫病[9]。

库蠓体型微小、鉴别特征稀少，传统分类鉴定尚存在诸多问题。首先是非成虫阶段的虫态和虫体残缺的成虫均难以鉴定，其次受库蠓性别限制，雄虫借助外生殖器等形态特征易于鉴别，而雌虫缺乏良好的尾器特征而不易鉴别，最后库蠓表型可塑性和遗传可变性等也容易导致误判[10-12]。因此，库蠓分类中亟需快速、准确鉴定种类的技术方法，对蠓传疾病的监控、防治具有重要意义。

随着分子生物学和生物信息学的快速发展，分子生物学技术已应用于昆虫分类鉴定和系统演化等领域，这在很大程度上弥补了传统形态分类的不足，尤其是近似种或隐种的分类[13-15]。在昆虫核基因中，串联重复是核糖体DNA(rDNA)的存在形式，同时其一个转录单元包括18S、5.8S、28S三个部分，而ITS1和ITS2两个可变区则分别位于18S和5.8S以及5.8S 和28S之间[16]。目前，昆虫分子系统学研究也主要集中在rDNA的ITS、28S rRNA和18S rRNA等区域。高度保守的序列通常应用于高级分类阶元的系统发育研究，如28S rRNA和18S rRNA[17]；而变异较大、选择压力小的序列则适用于种属水平上的研究，如ITS1和ITS2序列[18]，且已广泛应用于媒介昆虫的种类鉴定[19-20]。然而，蠓科昆虫的分子系统学研究，自1992年Tabachnick等[21]报道变翅库蠓(Culicoidesvariipennis)种群的基因差异开始，之后国外关于蠓科分子系统学的研究与日剧增[22-26]，但国内相关研究严重不足。

因此，本研究以埃蠓属的环纹埃蠓Alloheleaannulata为外群，对库蠓属中的凹缘库蠓C.holcus、连斑库蠓C.jacobsoni、印度库蠓C.indianus、荒川库蠓C.arakawai、霍飞库蠓C.huffi和肩宏库蠓C.humeralis等6种库蠓进行分类研究(凹缘库蠓C.holcus、和连斑库蠓C.jacobsoni为二囊亚属近似种)，通过联合形态学特征和核糖体DNA-ITS1序列数据，弥补传统形态鉴定的不足，进一步证实ITS1序列在库蠓及其近似种的分类鉴别方面的适用性，为解决蠓科昆虫分类中形态学数据难以解决的问题提供更多的数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1库蠓标本 本研究共使用7种23只蠓虫标本的数据，其中18只为本研究组2015年7月采自广西大瑶山自然保护区，其余5只的数据来自GenBank数据库，详见表1。

1.1.2主要试剂及仪器 基因组提取试剂盒(QIAGEN, 德国)、pEASY-T1克隆试剂盒(北京全式金公司, 中国)、PCR MasterMix(TIANGEN, 中国)、引物(上海捷瑞生物工程有限公司)、琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN, 中国)、琼脂糖(Biowest Agarose, 西班牙)、PCR扩增仪(美国BOI-RAD公司)、UVP凝胶成像系统(美国BOI-RAD公司)等。

1.2 方法

1.2.1库蠓采集 采用网捕法和灯诱法，在广西大瑶山自然保护区不同生境设置采样点进行蠓虫收集，并将其保存于无水乙醇中。

1.2.2标本鉴定 按照常规方法进行标本的分选、解剖、制片、鉴定以及拍照，且胸部标本单独编号保存在无水乙醇中。

1.2.3基因组DNA 将库蠓标本研磨至无明显组织块，按照QIAGEN DNeasy Blood& Tissue Kit说明书进行其基因组DNA提取，并保存至-20 ℃备用。

1.2.4PCR扩增 PCR扩增的上游引物为PanCulF (5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGG-3′)，下游引物为PanCulR (5′-TGCGGTCTTCATCGACCCAT-3′)，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR扩增的体系如表2所示，其反应条件为94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，40 ℃ 60 s，68 ℃ 60 s，循环5次；94 ℃ 60 s，44 ℃ 60 s，68 ℃ 60 s，循环35次；最后68 ℃延伸10 min。

表1 供试库蠓的详细信息Tab.1 Detailed information of the biting midges in this study

表2 PCR扩增体系Tab.2 PCR amplification system

1.2.5PCR扩增产物纯化、克隆及测序 将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，同时利用DNA回收试剂盒进行DNA产物的纯化，之后使用pEASY-T1克隆试剂盒进行DNA克隆，最后用60%甘油保存阳性克隆菌液并送至上海生物工程股份有限公司进行双向测序。

1.2.6rDNA-ITS1序列分析 利用Clustal X、DNA MAN、MEGA 6.06等软件对本研究中rDNA-ITS1序列进行比对、编辑、比较等分析，统计序列中各碱基(A、T、C、G)的组成比例以及保守位点(Conserved sites, C)、变异位点(Variable sites, V)、简约信息位点(Parsim-Imformative sites, Pi)和自裔位点(Singleton sites, S)的数量。同时，以Kimura双参数模型计算遗传距离，并以环纹埃蠓A.annulata为外群，通过邻接法(NJ)、最大似然法(ML)构建分子系统树，并通过Bootstrap 1 000次自举检验系统树中各结点的置信值。

1.2.7统计学方法 采用SPSS 21.0软件进行统计分析，数据以均数±标准差表示。两两比较采用两独立样本t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1形态学特征对比 本研究内群的6种库蠓形态上比较接近，尤其是凹缘库蠓C.holcus和连斑库蠓C.jacobsoni最为近似，以凹缘库蠓C.holcus、连斑库蠓C.jacobsoni和荒川库蠓C.arakawai为例(表3、图1)进行形态特征比较。上述3种库蠓中雄虫可根据其尾器的4个特征进行有效鉴别，但雌虫中仅荒川库蠓C.arakawai可直接根据头部、翅部和腹部的明显差异进行准确区分，另外二囊亚属的两近似种除翅部特征的细微差别外，余未见差异，故鉴定非常困难。

表3 本研究三种库蠓形态特征对比Tab.3 Comparison of morphological features of three Culicoides

1：凹缘库蠓C.holcus；2：连斑库蠓C.jacobsoni；3：印度库蠓C.indianus；4：荒川库蠓C.arakawai(雌)；5：荒川库蠓C.arakawai(雄)；6：环斑埃蠓A.annulata；7：霍飞库蠓C.huffi；8：肩宏库蠓C.humeralis图1 库蠓近似种一侧翅图Fig.1 Wing of one side of sibling species

2.2DNA序列分析 本研究获得的DNA序列经Clustal W比对和人工校对后，得到rDNA-ITS1的序列长度为352 bp，该序列中存在较多的插入和缺失位点。通过MEGA 6.06软件分析ITS1序列中T、C、A、G四种碱基的平均含量分别为36.8%、13.0%、30.0%和20.1%，其中A+T平均含量约为66.8%，C+G平均含量约为33.1%；而在3个密码子位点中，第1位点的A+T含量相对最高(67.7%)，第3位点A+T平均含量相对最低(64.6%)。此外，ITS1序列中保守位点(C)、变异位点(V)、简约信息位点(Pi)和自裔位点(S)的个数分别为163、189、182和7，其中变异位点(V)占比约为53.7%。

2.3序列同源性比对 将本研究所获全部库蠓ITS1序列与GenBank数据库中的序列进行同源比对，搜索到部分同源序列，即荒川库蠓C.arakawai(登录号：AB462265、AJ489503，序列相似度：99%)、连斑库蠓C.jacobsoni(登录号：AB462262，序列相似度：97%)、印度库蠓C.indianus(登录号为AB462268，序列相似度：93%)。

2.4遗传距离 利用MEGA 6.06软件计算本研究中蠓虫ITS1序列的遗传距离，种内和种间的遗传距离范围分别为0.000～0.020和0.113～0.621，通过统计软件分析得出种内组和种间组的遗传距离(均数±标准差)分别为0.009±0.008和0.391±0.169，两者差异具有统计学意义(t=32.430,P<0.05)。

2.5系统发育分析 以环纹埃蠓A.annulata为外群，采用邻接法(NJ)和最大似然法(ML)分别构建6种库蠓的系统发育树，得到基本一致的拓扑结构(图2、3)。系统发育树聚类分析表明：1)各物种间分别构成单系(群)，同种不同地理种群聚为一支，且种间无交叉。2)物种间亲缘关系明显，二囊亚属的凹缘库蠓C.holcus和连斑库蠓C.jacobsoni两种首先聚在一起，亲缘关系较近并构成一个姊妹群，再与库蠓亚属的印度库蠓C.indianus并为一大支，同时带纹亚属的荒川库蠓C.arakawai与三囊亚属的肩宏库蠓C.humeralis亲缘关系较近先聚为一小支，再与屋室亚属的霍飞库蠓C.huffi结合构成一大支，之后两大支聚合形成内群，而外群埃蠓属的环纹埃蠓A.annulata在树的根部，外群与内群形成完整的有根树。

各分支上的数字为自举检验置信值1 000次图2 基于rDNA-ITS1序列构建的NJ树Fig.2 Neighbor-Joining tree constructed based on rDNA-ITS1 sequence

各分支上的数字为自举检验置信值1 000次图3 基于rDNA-ITS1序列构建的ML树Fig.3 Maximum Likelihood tree constructed based on rDNA-ITS1 sequence

3 讨 论

核糖体DNA内转录间隔区1 (nuclear ribosomal DNA internal transcribed spacer 1, rDNA-ITS1)基因位于核糖体DNA的18S和5.8S之间，其特点为：①属于中度重复序列；②不承担编码蛋白质的功能，也不参与核糖体的形成，故承受的选择压力较小，进化速度相对较快，从而具有高变性；③在ITS1序列两侧的18S和5.8S序列具有保守性，便于通用引物的设计、PCR扩增和测序；④序列的组成、长度以及折叠方式存在多态性，可用于属、种和种群水平的研究[27-28]。目前，应用ITS1解决亲缘关系较近的库蠓分类以及系统关系的研究较多，如Mathieu等[29]通过设计ITS1-5.8S-ITS2 的TaqMan 探针对不显库蠓(Culicoidesobsoletus)和苏格兰库蠓(Culicoidesscoticus)进行双重实时荧光定量PCR实验，Deblauwe等[30]通过设计ITS1的DNA微阵列形式的探针杂交对不显库蠓种群(Obsoletusgroup)的库蠓进行分子鉴定，说明ITS1是库蠓种间和种内遗传分化程度及系统进化研究的良好指标。因此，基于库蠓形态特征和rDNA-ITS1序列数据的基础上对6种吸血蠓进行鉴定和分析，其研究结果表明形态学特征与分子数据具有一致性，共同验证了rDNA-ITS1基因序列在吸血库蠓(包括近似、近缘种)鉴别和系统发育研究中的适用性。

本研究rDNA-ITS1序列的碱基组成中A+T的平均含量(76.8%)远高于C+G的平均含量(33.2%)，具有AT偏向显著。同时，该序列的变异位点(189个)较多，占比约为53.7%，且相对于线粒体基因(如COI和Cytb)其还存在较多的插入和缺失位点。Cêtre-Sossah等[31]利用ITS1序列对盛行于非洲和欧洲的蓝舌病及非洲马瘟病的主要传播媒介库蠓——残翅库蠓C.imicola进行分子鉴定，通过设计特异引物可得到长度各不相同的ITS1扩增产物，根据电泳条带的位置即可进行种类鉴别；同时，Gomulski等[32]利用rDNA-ITS2序列探究库蠓亚属及近缘种的系统发生，研究发现其存在明显的多态性，表明绝大多数库蠓的ITS序列存在多态性，而并非是由于PCR扩增过程中产生的错误所致。

进一步对库蠓遗传距离研究发现，各种间遗传距离(0.113～0.621)明显大于各种内遗传距离(0.000～0.020)，其中最大种内遗传距离(印度库蠓C.indianus：0.020)亦小于最小种间遗传距离(凹缘库蠓C.holcus与连斑库蠓C.jacobsoni：0.113)，进一步说明库蠓种间和种内遗传距离不存在重叠区，足以进行准确区分。同时，种间平均遗传距离(0.411)为种内平均遗传距离(0.010)的41倍，也完全符合Hebert 等[33-34]提出的物种鉴定规则。因此，rDNA-ITS1基因可应用于库蠓的分子分类。然而，本研究中印度库蠓C.indianus的种内遗传距离相对其他种类略大(0.020)，Matsumoto等[35]在基于ITS1和ITS2对25种库蠓进行研究的过程中发现印度库蠓C.indianus存在ITS1长和短两种序列类型，这可能就是造成本研究中其种内遗传距离偏大的原因。另外，关于昆虫近缘种杂交的问题，Pesson等{36]在对白蛉亚科昆虫进行研究时发现其确实存在近缘物种杂交，但本研究中采自统一地点的凹缘库蠓C.holcus和连斑库蠓C.jacobsoni并未发现任何基因渗透现象，这与Ritchie等[37]和Augot等[15]关于库蠓的研究结果相一致。

此外，在对6种库蠓的DNA序列聚类分析研究中发现，其与形态学鉴定和遗传距离计算的结果基本相同，如凹缘库蠓C.holcus和连斑库蠓C.jacobsoni两近似种同属二囊亚属，其形态学特征相似且种间遗传距离(0.113)最小，在系统发育树中优先聚在一起构成姊妹群。然而，来自日本的连斑库蠓C.jacobsoni(AB462262.1)与我国广西的种类首先分开，从拓扑结构上来看我国广西的凹缘库蠓C.holcus和连斑库蠓C.jacobsoni聚为一支，但是从时间节点和分支长短来看同属连斑库蠓C.jacobsoni的种类具有更近的亲缘关系。此外，构建的NJ树和ML树的拓扑结构也基本一致，在种间和种内的分支上均具较高的置信值，说明应用rDNA-ITS1基因构建的分子进化树能明显区分库蠓及其近似种，可靠程度较高。然而，荒川库蠓C.arakawai和肩宏库蠓C.humeralis的种内存在置信值高低不等的差异，这与Gomulski 等[38]在基于同为核糖体DNA-ITS区的 ITS2序列对包括不显库蠓Culicoidesobsoletus在内的二囊亚属进行系统发育关系的研究过程中的情况类似，究其原因可能主要是两种建树方法之间存在建树理论基础和建树偏向性方面的差异。与此同时，在种内个别分支上亦存在相对较低的置信值，如凹缘库蠓C.holcus和连斑库蠓C.jacobsoni之间的置信值仅为51，这与李玮玮[39]等对小蔗螟的研究以及秦芳[40]等对利川马遗传多态性的研究得到的结果相似，其可能是由于ITS1序列在碱基组成及变异速度方面存在差异以及ITS1序列片段短(352 bp，且存在插入和缺失位点)和样本数量少(n=23)等导致提供的有效分子遗传学信息有限有关。

在广泛使用ITS1等核糖体内转录间隔区的基因序列进行分析时，发现它存在基因的横向转移、重复以及外显子拼接、域拼接等非线性的现象，说明其并非对所有物种都具有适用性[28]。同时，在核基因组研究中发现其存在线粒体假基因(NUMTs)的插入现象，这毋庸置疑是影响核基因的分子鉴定过程中准确性的又一不利因素[41]。目前，蠓科学者在进行库蠓的系统发育分析时，不仅仅是从传统形态学角度进行单因素的分析，同时还联合线粒体基因、核基因，甚至是三维形态重建等多方面进行综合比对分析，如Augot等[15]联合Cytb、CO I、ITS1和形态学特征可进行翅痣库蠓(Culicoidesstigma)和帕罗库蠓(Culicoidesparroti)等近似种的准确鉴别。同时，分类学家们也在不断发掘新的分子标记和分类技术，如CAD基因和几何形态学等在库蠓的分子系统学研究中的应用[42-43]。因此，在后续的昆虫分子系统学研究领域中的趋势将是结合生态学、形态学特征和多个分子标记数据等多重分类变量以及开发新分子标记和分类技术来进行更为全面、系统的分析。