长江中上游圆筒吻鮈群体线粒体Cyt b遗传多样性分析

蒲 艳，田辉伍，陈大庆，段辛斌，刘绍平，汪登强

(1.西南大学生命科学学院，重庆 400715；2.中国水产科学研究院长江水产研究所，农业部长江中上游渔业资源环境科学观测实验站，武汉 430223)

圆筒吻鮈(Rhinogobiocylindricus)，隶属于鲤形目(Cypriniformes)鲤科(Cyprinidae)鮈亚科(Gobioninae)吻鮈属(Rhinogobio)，主要分布在长江上游干流及其支流(如岷江、金沙江、嘉陵江等)[1-2]，近年有研究表明在长江中游也有分布[3]，是长江主要经济鱼类[4]。圆筒吻鮈喜生活于流水或缓流水环境，有洄游产卵行为[5]，主要以底栖生物(如摇蚊幼虫)为食[6]。资源调查表明，目前长江上游圆筒吻鮈资源开发率偏高，存在过度开发现象，资源量呈下降趋势[9]。圆筒吻鮈产漂流性鱼卵，受精卵随江水漂流发育，长江干流水利工程建设改变了河流自然水文状况、流水江段长度变短、阻隔了鱼类的洄游通道[4]，严重影响了其种质资源，大坝建设对圆筒吻鮈繁殖习性同样产生严重影响，进一步威胁其生存。迄今，有关圆筒吻鮈研究报道主要在生物学[4]、物种分化[7]、组织学[8]、资源量[9]等方面，在遗传学方面，曾晓芸对其遗传结构分析也有了初步研究[10]，其研究区域为长江上游宜宾至万州库区江段以及主要支流，属于长江上游及其支流，而长江中游却未见相关报道。

线粒体DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)因结构简单、呈母系遗传、拷贝数量大、进化速率快、无组织特异性等特点，被广泛运用于物种分化、群体遗传多样性[10，19]、种属亲缘关系远近等研究中[11]。细胞色素b(Cytb)基因的结构和功能在mtDNA 13个蛋白质编码基因中了解的最为全面，且其进化速度适中、转换或颠换占很大比例等特点，被认为是研究种内或近缘中间系统发育、种质资源状况和群体遗传结构的理想工具，成为鱼类遗传多样性研究中常见的分子标记[14，26，27]。本实验采用线粒体Cytb序列分析长江中上游圆筒吻鮈群体的遗传多样性及种群结构，以阐明其遗传多样性和群体分化状况，为圆筒吻鮈种质资源开发和保护提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

2017年7～10月在长江上游干流的宜宾(YB)、泸州(LZ)、合江(HJ)、江津(JJ)、巴南(BN)、涪陵(FL)及长江中游的黄冈(HG)7个采样点共采集圆筒吻鮈140尾(表1)，各采样点位置见图1。所有样本根据其形态鉴定后剪取鳍条，保存于无水乙醇。

图1 采样点地理位置Fig.1 Sampling stations of R.cylindricus in the Yangtze River

1.2 基因组DNA提取、PCR扩增及测序

剪取适量鳍条，双蒸水洗去乙醇，用高盐法提取总DNA[12]。用鱼类通用引物扩增线粒体DNA Cytb序列，引物序列为L14724：5′-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3′和H15915：5′-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3′[13]。PCR 扩增体系50 μL，包括：10× buffer(Mg2+)5 μL，dNTPs(10 md/L)0.5 μL，正反引物各2 μL，Taq DNA Polymerase(2 U)0.4 μL，50 ng/μL DNA模板2 μL，灭菌去离子水补至50 μL。反应程序如下：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃再延伸8 min。用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 扩增产物，条带明亮、清晰、单一的样品，交由生物公司进行双向测序，测序引物与PCR扩增引物相同。

1.3 数据处理

采用Lasergene v7.1软件包的Seqman进行拼接，序列的对位排列用Clustal X软件完成。用MEGA v6.0分析软件统计序列的碱基组成、转换/颠换比率，并构建邻接系统发育(NJ)树，树检验采用bootstrap法，设1 000次重复。使用DnaSP v5.0获得单倍型分布，统计变异位点(s)、单倍型数目(h)、单倍型多样性指数(Hd)和核苷酸多样性指数(Pi)，并进行中性检验和歧点分布分析及Nm值计算。应用Arlequin v3.11软件进行AMOVA分析及群体的遗传分化指数FST。使用Network v5.003程序构建单倍型网络结构图，对单倍型之间的进化关系进行分析。根据公式τ=2 ut估算种群扩张时间，其中τ是扩张时间参数；u=2μk，其中μ为每个核苷酸的变异速率，k为序列长度；t表示自扩张以来所经历的代数；扩张时间T=t×代时。Beast 2.4.3.0进行Bayesian Skyline Plots(BSP)分析，采用鲤科鱼类常用的进化速率每百万年1%[14]，MCMC长度为100 000 000，在TRACER ver.1.4构图，各项参数的ESS均大于200。

2 结果与分析

2.1 序列变异

经校正和比对后得到圆筒吻鮈线粒体Cytb有效序列长度为998 bp，约为Cytb基因全长的87%。序列中的转换数(Ts)明显高于颠换数(Tv)，Ts/Tv =6.01。A、T、C、G的平均含量分别为27.64%，30.85%，27.11%和14.40%，A+T(58.49%)大于C+G(41.51%)，并显示明显的反G含量倾向，与其他硬骨鱼类的情况相似。

在998 bp序列中发现14个变异位点，其中7个单一突变位点，另7个为简约信息位点，序列间平均核苷酸差异数(K)为0.772。140个个体中共检测到15个单倍型(GenBank登录号：MH673879-MH673893)，其中单倍型H_4出现的频率最高，为58.6%，其次是H_2(13.6%)和H_3(12.1%)，有7个单倍型仅出现1次。7个群体中，江津群体的单倍型数最多为13个，涪陵的单倍型数最少，仅有1个(表3)。群体平均单倍型多样性指数和核苷酸多样性指数分别为0.625和0.000 77，最高的是泸州群体，其次是巴南群体，涪陵群体最低(表1)。

表1 圆筒吻鮈线粒体Cyt b遗传多样性Tab.1 Genetic diversity parameters within R.cylindricus based on mtDNA Cyt b sequences

2.2 群体遗传结构

群体间分子变异方差分析(AMOVA)显示，群体主要变异来源为群体内，占101.00%，群体间的遗传分化指数FST为 -0.998%(P>0.1)(表2)，表明圆筒吻鮈7个群体间未出现显著遗传分化。

表2 圆筒吻鮈群体间分子变异分析Tab.2 Analysis of molecular variance(AMOVA)among R.cylindricus populations

对两两群体间的FST值进行计算(表4)，种群间FST值均低于0.05，说明群体之间未出现遗传分化。Nm值表示群体间基因交流程度，其Nm>1则表明群体间存在基因交流[15]，经计算总群体Nm值为115.80，两两群体Nm值见表4。

表3 圆筒吻鮈群体线粒体Cyt b序列单倍型数目及分布Tab.3 MtDNA Cyt b haplotype distribution across R.cylindricus populations

表4 圆筒吻鮈群体间的FST值(对角线下方)和基因流Nm值(对角线上方)Tab.4 Pairwise FST(below diagonal)and Nm values(above diagonal)among R.cylindricus populations

利用NETWORK里Nedian Joining方法构建圆筒吻鮈Cytb序列的单倍型网络结构如图2所示。圆筒吻鮈单倍型网络结构图以H_4为中心呈星状结构，相邻单倍型之间均是通过一个突变步骤连接。

以长鳍吻鮈(R.ventralis)为外类群，采用NJ法(neighbor-joining)构建的单倍型系统发育树如图3所示，系统树未出现高支持率(均低于60%)的分支，说明群体内部没有明显遗传分化。

图2 基于线粒体Cyt b序列构建圆筒吻鮈单倍型网络结构图Fig.2 Haplotype network of R.cylindricus based on the mtDNA Cyt b sequences

图3 圆筒吻鮈线粒体Cyt b 单倍型NJ树Fig.3 NJ phylogenetic tree of mtDNA Cyt b in R.cylindricus

2.3 历史种群动态

种群扩张历史动态利用Tajima′sD和Fu′sFs中性检验和碱基错配来评估。中性检验的Tajima′sD=-1.821 88(P<0.05)及Fu′sFs=-12.199(P<0.05)，均为显著性负值。单倍型错配分布分析显示圆筒吻鮈群体的歧点分布表现为单峰(图4)且BSP分析结果均表明圆筒吻鮈近期发生过经历过种群扩张。鲤科鱼类常用的进化速率每百万年1%[14]，根据τ=1.179，计算圆筒吻鮈在距今0.06 Ma(百万年)前发生过种群扩张。

图4 圆筒吻鮈Cyt b序列单倍型错配分布图及BSP分析Fig.4 Mismatch distribution(A)and BSP analysis(B)of R.cylindricus based on the mtDNA Cyt b sequences

3 讨论

3.1 遗传多样性

遗传多样性是生物多样性的总和，存在于生物种群间、种群内，是生物对环境适应性和进化的基础，物种遗传多样性的高低通常与该物种对环境的适应能力具有一定的线性关系，表现为遗传多样性越高，则表明对环境的适应能力越强[16-17]。单倍型多样性指数(Hd)和核苷酸多样性指数(Pi)是衡量物种遗传多样性水平高低的两个重要指标[18]，Pi值越大则表示群体多态性较高，反之亦然[16]。与长江上游其它鱼类，如红唇薄鳅(L.rubrilaris)[19](Pi=0.006)、长鳍吻鮈[20](Pi=0.001)、异鳔鳅鮀(X.boulengeri)[21](Pi=0.002)等比较，长江中上游圆筒吻鮈群体遗传多样性处于较低水平。本研究以前，曾晓芸[10]也采用Cytb分析过长江上游圆筒吻鮈群体遗传结构，得到Pi=0.010 06，明显大于本研究的结果，暗示圆筒吻鮈群体遗传多样性存在下降趋势。从单倍型来看，曾晓芸的研究结果中，频率最高的3个单倍型(Hap_1：45.1%、Hap_2：20.5%和Hap_3：8.2%)占总样本量为73.8%，本研究的频率最高的3个单倍型比例为84.3%，提示近年来圆筒吻鮈群体同质化有所提高，值得关注。造成圆筒吻鮈遗传多样性下降的原因可能是过度捕捞造成种群大小下降，引起群体遗传漂变加剧。研究表明，长江上游圆筒吻鮈资源开发率偏高[6，9]，资源量呈下降趋势。

研究还发现位于三峡库区的库尾涪陵群体没有检测到遗传变异，仅有一个单倍型(表3)。圆筒吻鮈属喜流水性鱼类，涪陵江段在三峡水库低水位时江水存在一定的流动性，高水位时，江水几乎不流动，因此不是圆筒吻鮈适宜的栖息地，但该江段的研究有助于分析大坝建设形成的水库对喜流水性鱼类的影响。本研究还显示，长江中游的黄冈群体遗传多样性较低(表1)，有研究表明长江上游圆筒吻鮈资源量大于中游[3，9]，说明长江上游较中游而言是圆筒吻鮈较适宜的栖息地，并且圆筒吻鮈在中游面临与更多大型鱼类竞争食物的压力等，这些可能是造成其群体遗传多样性降低的原因。但由于这两个群体的样本量比较少，还需要加强采样，进一步研究。

3.2 遗传结构及种群历史

溯祖理论[22]认为分布最广泛的单倍型为原始单倍型。基于Cytb序列的单倍型网络结构图(图2)显示，H_4位于网络结构中心，为主要单倍型，在7个群体中均有分布，说明H_4单倍型的圆筒吻鮈对环境的适应能力较强。AMOVA和基因流及两两群体之间的遗传分化分析均表明长江中上游圆筒吻鮈群体遗传分化不显著(表2和表4)，但基因流检测显示，涪陵群体与其它群体(泸州群体除外)的Nm均小于4，黄冈群体与其他群体(泸州群体除外)的Nm值也均小于4(表4)，说明这些群体间的基因交流可能存在一定障碍。考虑到涪陵和黄冈群体样本量小，Cytb序列的变异位点数量也较少，对分析的结果可能会造成一定的影响，因此有必要采集更多样本和采用多态性更高的标记，如mtDNA控制区[23]、微卫星DNA等进一步研究验证。

Grant等[24]根据海水鱼类单倍型多样性和核苷酸多样性的高低推测群体历史状况之间的关系，可分为四种情况：(1)低单倍型多样性(<0.5)和低核苷酸多样性(<0.005)，说明种群近期发生瓶颈或奠定者由单个或少数mtDNA谱系组成；(2)高单倍型多样性和低核苷酸多样性，说明群体种群发生瓶颈后迅速增长并积累突变；(3)低单倍型多样性和高核苷酸多样性，说明地理隔离的亚群体出现分化；(4)高单倍型多样性和高核苷酸多样性，说明具有长进化历史的稳定群体或有谱系差异的群体再次融合。本研究结果显示，圆筒吻鮈群体遗传多样性与上述第二种类型相符，说明圆筒吻鮈群体发生遗传瓶颈和群体扩张历史，这与中性检验、碱基错配分布及BSP分析的结果吻合。研究表明，长江上游的一些鱼类如红唇薄鳅、长薄鳅(L.elongate)[19]、长鳍吻鮈[20]在长江上游末次冰期，即大理亚冰期(1～11万)发生过种群扩张，此时期长江上游气温回升，有利于鱼类的生存和扩张[25]。

3.3 保护建议

本研究显示，长江中上游圆筒吻鮈群体没有发生遗传结构分化，与之前研究结果比较，其圆筒吻鮈群体遗传多样性存在下降趋势，需要开展长期遗传多样性监测。近年来，渔民为了获得更多利益而改变了网具规格，不断缩小其网具的捕捞规格，资源量不断减少，有效繁殖群体难以恢复。因此，应采取有效措施(如禁渔期、渔民转业等)并加强对圆筒吻鮈的保护力度。从本研究得知，7个群体之间及群体内部都没有明显的遗传分化，因此，我们建议将圆筒吻鮈作为一个整体进行就地保护，并开展长期监测。