嘉陵江合川段秋季微生物多样性研究

但 言，沈子伟，余凤琴，张 闯 ，倪朝辉，黎 春

(1.重庆市水产科学研究所，重庆 401120 2.中国水产科学研究院长江水产研究所，农业部长江中上游渔业资源环境科学观测实验站，武汉 430223 3.重庆市巫山县农业委员会，重庆巫山 404700)

水是维持人和动物生命及渔业、工农业生产的最基本也是最重要的资源。而水中含有丰富的营养元素及有机物，亦使其成为微生物生产和繁殖的重要场所[1]。微生物是河流生态环境中的主要初级生产者[2]。河流环境的变化会对河流微生物的种群分布造成影响，因此河流微生物的种群分布可以作为判断河流生态环境是否遭到破坏的生物指标[3]。近年来分子生物学快速发展，低成本、自动化的高通量测序技术[4，5]，能同时对样品中的优势物种、稀有物种及一些未知的物种进行检测，快速准确地获得样品中微生物群落的组成，在河流[6]和湖泊水库[7]的微生物群落结构研究中得到广泛应用。

嘉陵江为长江上游的主要支流，对嘉陵江的水体研究主要包括浮游生物多样性[8，9]、有毒重金属研究[10，11]和营养盐浓度[12-14]，尚未见水体和底泥微生物群落的相关研究，尚不清楚嘉陵江水体的微生物群落组成与其环境因子的关系。本研究在嘉陵江下游合川段草街电站库区范围内开展。基于16S rRNA V4区域扩增子测序分析技术，在9月份对嘉陵江合川段进行采样，分析水体和底泥微生物结构特征及其与环境因子的关系，以期为嘉陵江流域的环境监测和污染防治提供基础数据。

1 材料和方法

1.1 研究区概况

嘉陵江位于东经103°45′～109°00′，北纬29°20′～34°25′之间，其左右岸支流(渠江和涪江)在合川城区汇入嘉陵江干流，而后在重庆朝天门汇入长江。

在利泽(LZ)、渠江口(QJ)、涪江口(FJK)、草街(CJ)设置4个采样断面，其中利泽断面在渠江口上游，草街断面在草街水库大坝以上(图1)。水体样品以S.LZ、S.QJ、S.FJK、S.CJ表示，底泥样品以N.LZ、N.QJ、N.FJK、N.CJ表示。

图1 采样点分布图(1.利泽，2.渠江口，3.涪江口，4.草街)Fig.1 The location of the sampling sites

1.2 样品采集

1.3 样品DNA提取、PCR和16S rDNA测序

水样和底泥样品送至诺和致源公司(北京)，分离水样和底泥基因组DNA用于16S rRNA基因的扩增和测序。细菌DNA提取按照CTAB方法进行。扩增区域为16S V4，扩增引物为515F-806R。酶和缓冲液：使用New England Biolabs 公司的PhusionHigh-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer。反应程序：98 ℃预变性1 min；98 ℃10 s，50 ℃30 s，72 ℃30 s，30个循环；72 ℃ 5 min。PCR 反应体系和程序(30 μL)：Phusion Master Mix(2×)15 μL，Primer(2 μmd/L)3 μL(6 μmd/L)，gDNA(1 ng/μL)10 μL(5～10 ng)，H2O 2 μL。各样品PCR扩增后，利用HiSeq进行上机测序。

1.4 测序数据分析

对原始数据进行拼接、过滤，得到有效数据，然后基于有效数据进行OTUs(operational taxonomic units)聚类和物种分类分析，并将OTU和物种注释结合，从而得到每个样品的OTUs 和分类谱系的基本分析结果。再对OTUs 进行丰度、多样性指数等分析，同时对物种注释在各个分类水平上进行群落结构的统计分析。最后在以上分析的基础上，进行一系列的基于OTUs、物种组成的聚类分析，主成分分析(principal component analysis，PCA)、典型相关分析(canonical correlation analyses，CCA)等统计比较分析。

2 结果

2.1 微生物群落多样性指数分析

利用诺和致源公司线上分析平台分析4个采样点水样和底泥中的微生物多样性指数，包括：观察物种指数(obsevered species)、香农指数(Shannon index)、辛普森指数(Simpson index)和ACE指数等。水体中obsevered species指数介于678～989之间，底泥介于1 362～2 219之间。水体中香农指数介于3.27～6.89之间，辛普森指数介于0.68～0.97之间；底泥香农指数介于5.49～8.35之间，辛普森指数介于0.88～0.98之间，说明样品的均匀度和多样性较好。水体中Chao 1指数介于932～1 343之间，AEC指数介于1 012～1 399之间；底泥中Chao 1介于1 970～2 560之间，AEC指数介于1 895～2 637之间，表明样品的丰度较大。

图2为嘉陵江合川段水体和底泥中微生物丰度指数图，由图2可以看出：草街水体和底泥中微生物的多样性较其他3个监测点均为最佳。

表1 微生物多样性指数分析Tab.1 Analysis of microbial diversity index

图2 水体和底泥中主要优势菌门群落结构组成Fig.2 Composition of the main dominant microbial community structure in water and sediment

2.2 微生物群落组成

嘉陵江合川段水体中优势微生物门类有：变形菌门(Proteobacteria，53.2%)、厚壁菌门(Firmicutes，23.1%)、放线菌门(Actinobacteria，11.8%)、拟杆菌门(Bacteroidetes，4.9%)、蓝细菌门(Cyanobacteria，9.6%)、浮霉菌门(Planctomycetes，1.9%)、疣微菌门(Verrucomicrobia，1.1%)、酸杆菌门(Acidobacteria，1.0%)、绿菌门(Chlorobi，0.5%)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes，0.2%)。底泥中优势微生物门类有：变形菌门(Proteobacteria，42.2%)、拟杆菌门(Bacteroidetes，32.3%)、厚壁菌门(Firmicutes，8.0%)、放线菌门(Actinobacteria，4.3%)、酸杆菌门(Acidobacteria，3.4%)、疣微菌门(Verrucomicrobia，2.3%)、绿菌门(Chlorobi，1.2%)、浮霉菌门(Planctomycetes，1.1%)、硝化螺旋菌门(Nitrospira，0.9%)、Ignavibacteriae(0.5%)。

2.3 微生物群落的空间分布

从嘉陵江合川段水体和底泥的微生物聚类树状图(图3)中可直接看出8个样品之间微生物群落多样性的相似性。嘉陵江合川段水体和底泥中的微生物群落结构组成均差异较大。4个水体样品中均可聚为一类，说明各水体样品中的微生物群落组成较为相似。而底泥中利泽与其他3个样品的微生物群落表现出较大的差异，涪江口和渠江口聚类较近，微生物群落的结构较为相似。

图3 微生物聚类树状图Fig.3 Microbial clustering tree

图4为微生物PCA分析，图中的点代表各样品，样品间的相似度越高则在图中越近，反之样品间相似度越低则在空间距离越远。由图4也可以看出水体中的微生物相似度较高，而草街底泥中的微生物与其他样品的微生物结构差异较大。

图4 微生物PCA分析Fig.4 Microbial PCA analysis

2.4 物种丰度聚类热图分析

图5为微生物在genus水平物种丰富热度图，在水体中的优势微生物属有：氢噬胞菌属(Hydrogenophaga)，GKS98-freshwater-group属，Chthoniobacter属，鞘脂菌属(Phingobium)，Prevotella-6属，嗜冷杆菌属(Psychrobacter)，Masslilia属，Psychobacter属；而在底泥中有不动杆菌属(Acinetobacter)，杜檊氏属(Duganell)，Sporacetigenium属，Psychrobacillus属，Pseudarthrobacter属，Paeniglutamicibacter属，芽孢八叠球菌属(Sporosarcina)，Ferruginibacter，Chthoniobacter属，Fusibacter属，Unidentified-Nitrosomonadaceae属，Novosphinggobium属。

图5 微生物物种丰度聚类热图(a：水体，b：底泥)Fig.5 Abundance clustering heat map of microbial species

2.5 环境因子关联分析

CCA分析用来分析环境因子对微生物结构的影响，实验中监测的环境因子主要有：总磷(TP)、总氮(TN)、pH、悬浮物、高锰酸盐指数、溶解氧、石油类和挥发酚含量。各环境因子数据见表2，对各环境因子进行CCA分析，结果表明，水体TP、TN及pH和水体中微生物结构显著相关(P<0.05)，TP、TN及pH是影响水体中微生物结构的主要环境因子。而在这三个环境因子中，TP是影响草街水域微生物结构主要环境因子，TN是影响渠江口水域微生物结构的主要环境因子，pH是影响涪江口水域微生物结构的主要环境因子(图6)。

表2 水体环境因子Tab.2 Environmental factor of water

图6 环境因子分析Fig.7 Environmental factor analysis

3 讨论

3.1 水体和底泥微生物多样性差异

底泥样品中平均香农指数大于水体样品，表明水体和底泥中的微生物结构存在差异，底泥中微生物的种类更为丰富。可能是底泥环境复杂，满足厌氧微生物类群的生存环境条件，一系列的生物化学反应在此发生，因此底泥中微生物物种多样性更为丰富。

水体中的绝对优势种群门类为：变形菌门、厚壁菌门、放线菌门，底泥中的绝对优势种群为：变形菌门、拟杆菌门。水体中的特有优势种群为：蓝细菌门和芽单胞菌门，底泥中的特有优势种群为硝化螺旋菌门和Ignavibacteriae。其中变形菌门、放线菌门和拟杆菌门在淡水富营养化水体中都是十分常见的[15]，说明嘉陵江合川段水域2017年秋季有富营养化趋势。水体、底泥微生物群落特征及微生物指标评价研究[16]表明厚壁菌门是一类在废水、废弃物厌氧处理系统中起重要作用的微生物，在水体中出现较多的厚壁菌门，说明水体已面临污染胁迫。蓝细菌门在水体中占9.6%，提示水体有富营养化趋势。相关研究表明，一种可裂解蓝藻细胞的噬细胞菌(拟杆菌门细菌)的增多与水华的发生发展有紧密联系[17]，因此拟杆菌门可能与富营养化存在某种潜在关系[15]。此外，拟杆菌是一类常见于人和动物体内且大量存在的致病菌，其下面多个菌属可以分解高分子碳水化合物，例如多形拟杆菌具有分解多糖功能，底泥中拟杆菌比例相对较高，提示该区域受到人类活动较大影响。硝化螺旋菌门是一类硝化细菌，可将亚硝酸盐氧化成硝酸盐，底泥中的硝化螺旋菌门占0.9%，说明底泥中细菌硝化作用较为活跃，水环境自净能力较强。2012—2013年长江上游支流赤水河茅台地区水体微生物优势细菌类群为变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门，秋季(10月)优势细菌类群为变形菌门和拟杆菌门[18]，这与嘉陵江合川段水体中微生物优势物种组成类似，由此推测长江上游水体中微生物优势物种构成可能普遍相似。此外，茅台地区赤水河的研究结果[18]表明，某个季节微生物的多样性基本能反映地区全年的整体情况，因此对2017年秋季的嘉陵江合川段水域底泥微生物多样性进行分析，基本能够代表嘉陵江合川段全年微生物多样性的情况。

3.2 各采样点微生物组成分析

利泽和涪江口，渠江口和草街水体微生物物种多样性组成相似，表明河流上下游水体微生物物种组成均一性较好，采样位置差异对微生物物种多样性的组成影响不大。而Gao等[19]研究污染河流时发现上下游微生物物种组成存在差异，谭旭等[18]也发现茅台地区赤水河上游较下游微生物群落多样性有微弱的优势，这都与该研究结果不同，可能的原因是嘉陵江合川段处在草街水电站库区范围内，水生态环境较为均一，与自然河道有较大差异，且没有对微生物结构造成显著影响的持续污染源，因此河流上下游水体的微生物物种组成相似。而茅台地区赤水河流速大，水生态环境多样，下游生产生活对河水物质组成产生很大影响，因此上下游微生物组成表现出差异。但是，实验中各采样点微生物丰度的不同主要是人类活动的影响。下游草街采样点距草街电站距离较近，水文条件长期稳定，适宜微生物的繁殖，水体中各种微生物丰度均较大。茅台地区赤水河下游微生物丰度比上游样品高[18]，这与张旭[16]的研究结果相一致，说明河流微生物结构组成与水文环境和人类活动影响方式的不同密切相关。草街水域丰度较大的微生物为变形菌门、酸杆菌门、放线菌门、疣微菌门。其中放线菌可以吸收营养物质，对水体有净化作用[20]，疣微菌门则是富营养化水体中常见的细菌[21]。最上游采样点利泽微生物丰度也较大，主要为变形菌门和厚壁菌门。渠江口能分解有机物的[22]氢噬胞菌属丰度最大，涪江口处在合川城区，生活、生产及运输带入大量有机物，因此涪江口氢噬胞菌有机物分解作用较其他三个采样点更为活跃。

涪江口和渠江口底泥中微生物物种多样性组成相似，这两处采样点是嘉陵江与其支流涪江与渠江的汇合处，都分布在城区范围内。张旭[16]的研究结果表明，城区和郊区底泥表现出不同的微生物多样性，底泥微生物群落结构与区域相关，这也与本次研究结果相一致。从微生物丰度上看，丰度较大的微生物主要为不动杆菌属和杜檊氏属，杜檊氏属能够降解水体中的有机物，起到净化水体的作用[23]，这也与涪江口和渠江口地处城区有关。此外，我们还发现上游和下游的利泽和草街底泥中丰度较大的微生物较多，可能的原因是城区较为密集的人类活动导致某些微生物生长繁殖受到影响。

3.3 环境对微生物结构的影响

Wang等[24]表明，生态系统中微生物结构是非随机空间分布的，但影响微生物组成的主要环境因子并不固定。本研究中，总磷、总氮和pH对水体中微生物群落结构的变化有较大的影响。Sterner等[25]研究表明，细菌生长受到生物体和基质中N/P、C/N和C/P组成的影响。基质中元素比变化会引起细菌进行酶活性、基因表达和生理反应的调节，最终影响物种之间竞争和占位，并引起优势物种和生物多样性的改变[26]。

黄艺等[27]认为浮游细菌生物完整性指数(BP-IBI)可用于滇池流域生态健康的评价。张旭[16]以宁波境内河流为例建立了微生物生物性完整性指标，评价河流水体生态健康状况。微生物群落多样性是水环境敏感性生物指标之一，随着水环境的变化，具有不同的结构特征，水生态环境与微生物结构具有相关性，通过微生物群落结构变化能够预测环境质量的变化。开展嘉陵江乃至长江流域微生物结构研究，建立微生物指标评价，对水环境保护和水体及底泥污染的生物治理具有参考意义。