细胞内自由钙离子的测定
——荧光指示剂法

姚 洁 孙津歌 史乐谦 杨 琳

（天津师范大学生命科学学院天津市动植物抗性重点实验室 天津 300387）

前言

钙离子（Ca2+）是胞内重要信使分子提出于20世纪70年代。作为信号转导中重要的第二信使分子，Ca2+参与调节了许多生命活动，生命的起始、成长与终结都夹杂着钙离子的身影，例如触发受精过程，控制细胞的生长分化，甚至是成为细胞的损伤与凋亡中不可或缺的一环[1,2]。此外，Ca2+亦与植物的防御息息相关[3]。

细胞内的Ca2+是其介导的信号转导的基础，通常，细胞中的Ca2+含量极少，仅为0.1 μmol/L[4]。当受到外界刺激后，胞外Ca2+内流或胞内钙泵释放，导致细胞内的Ca2+浓度升高，进而引发一系列生理生化反应，因此，准确测定Ca2+浓度变化，具有重要的意义。

近年来，随着研究的深入，Ca2+的检测技术日益成熟，主要包括物理法和荧光测定法。而荧光测定法包括荧光蛋白指示剂法和钙荧光指示剂法[5]。本文主要对钙荧光指示剂法进行详细的介绍。

1 钙荧光指示剂法

钙荧光指示剂法是广泛应用的Ca2+检测技术之一，它是通过测定荧光强度反映细胞中钙离子的浓度。

1.1 荧光指示剂

1982年，胞内Ca2+浓度的测定技术取得了里程碑式的成功。美籍华裔科学家Tsien RY等[6]合成了第一代钙荧光指示剂，其中，效果最好的是Quin-2，它对钙的亲和性高，精确度高，但是光稳定性差，所需浓度高且检测的对象有限制，最好是处于静息状态下的细胞内的Ca2+[7]。

第二代的荧光指示剂均为双波长荧光染料，包括Fura-1、Fura-2、Fura-3、Indo-1。其中应用最广泛的是 Fura-2，Indo-1。Fura-2是典型的双激发荧光指示剂，当染料与Ca2+结合之后，激发波长从380nm(未结合Ca2+时)移向340nm，从而340nm处荧光强度上升，380nm处荧光强度下降[8]。Ca2+浓度最终不再仅仅单纯荧光强度的变化，而是取决于两者的荧光强度比值，精确度更高。第二代的荧光指示剂需要紫外光的激发，这不仅引起了样品的自发荧光，还会对细胞造成一定的损伤。

第三代荧光染料的代表是Fluo-3，为单波长指示剂，它的最大激发波长位于506 nm，避免了蛋白质、细胞器等物质的自发荧光干扰。其最大发射波长为526 nm，可以在远离340~380 nm波长范围内测得荧光。Fluo-3的灵敏性高，结合Ca2+后，其荧光强度提升了35~40倍。目前，Fluo-3已经广泛应用于植物组织器官中的 Ca2+测定[9]。

1.2 装载方法

一直以来，我们都是以细胞为实验对象，进行Ca2+浓度变化的研究。那么Ca2+能否进入细胞便至关重要。基于细胞是否受到损伤，可以将其分为损伤装载法和非损伤装载法[10]。

1.2.1 非损伤装载法

酸化装载法：在酸性条件下，离子型指示剂与氢离子结合，因其不带电荷故可以进入细胞，而在细胞内的中性环境下，发生解离并与Ca2+结合，从而进行Ca2+的检测。由于该方法所创造的酸性条件可能对实验对象造成影响，建议设置对照组。

酯化孵育法：借助于AM形式的亲脂性，指示剂可以顺利穿过细胞膜，进入细胞，然后被胞内的非特异性酯酶酶解为AM和指示剂，与Ca2+结合，进行检测[11]。该方法快速简洁，对细胞无损伤，但因细胞壁中非特异性酯酶的存在，无法广泛应用于植物细胞。然而，由Zhang W H,et al.[12]和尚忠林等[13]研究出的低温孵育法成功地解决了这一问题。该方法只需要在装载过程中先进行低温（4℃）处理，抑制细胞壁中酶的活性，同时又不影响指示剂扩散入细胞的过程[14]，从而成功装载。

1.2.2 损伤装载法

该方法包括电穿孔法、显微注射法、膜片钳负载法和基因枪法等，在此只对电穿孔法和显微注射法进行描述。

电穿孔法：利用高压脉冲电场，在细胞膜上形成一个可修复的小孔，荧光探针便由此进入细胞，与Ca2+结合。但该方法会对细胞造成较大的损伤。

显微注射法：显微注射[15]是利用微针对细胞进行操作，直接将指示剂导入细胞的方法。该方法可以向细胞中导入足量的指示剂，且避免了酯化探针（未被酯酶水解）的荧光残留，消除误差，但对操作设备及技术要求高，适用于个体较大的单细胞。

1.3 荧光强度的测定

荧光指示剂强度测量的常用仪器包括荧光分光光度计、荧光显微镜、流式细胞仪等。

1.3.1 荧光分光光度计法

荧光分光光度计利用比色法测定悬浮液中细胞群体的平均荧光强度，该方法简单快速，易操作，但影响其结果的因素较多，精确度不高，现基本不用。

1.3.2 数字共聚焦显微术

近年来，随着计算机技术的发展，计算机学科与生物学科的交叉也越来越多，尤其是在数据处理方面。数字共聚焦显微术就是基于此而出现的，它是通过荧光显微镜拍摄高分辨率的图像，然后运用相应软件对图像进行加工处理以及荧光强度的测定。该技术价格低廉且应用范围广，几乎适用于所有探针，尤其是在钙离子测定方面应用广泛。除此之外，它还可以进行双激发或双发射波长荧光探针的比率测定[16]。

1.3.3 流式细胞仪法

流式细胞仪中，细胞悬浮液在压力的作用下通过一根极细的小管，由于小管只允许单个细胞通过，使之成为单细胞液流。发射激光，使细胞产生荧光，然后利用光敏元件对其进行荧光强度检测。该法不仅可以用于钙离子浓度的测定，还可以用于特异蛋白含量测定以及细胞分选等。但是该法不适用于植物细胞，因其细胞偏大且带有细胞壁。

总结

钙离子作为第二信使分子，调控着细胞内许多重要的生物和病理过程，其重要性不言而喻，为了阐述其作用机理，研究胞内Ca2+浓度的变化势在必行。故近年来，荧光测定法飞速发展，荧光指示剂推陈出新，却屡有不足，无法适用于所有样品。但是随着科学技术的发展以及科研人员的努力，一定会有更完善的指示剂，更有效的方法出现。