藏红花水提液对高脂血症模型金黄地鼠肝脏保护作用研究

魏琳玲 丁 科

高脂血症是指血清中总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白（LDL）过高而血清高密度脂蛋白（HDL）过低的脂代谢异常疾病。作为动脉粥样硬化的重要因素之一，高脂血症会诱发一系列心脑血管疾病。近年来，越来越多的中药被用于治疗高脂血症的研究[1]。中药藏红花，又称西红花，是鸢尾科番红花Crocus sativus L.的干燥柱头。中医认为藏红花性甘，平，归心、肝经，具有活血化瘀，凉血解毒，解郁安神的功效。常用于经闭癥瘕，产后瘀阻，温毒发斑，优郁痞阏，惊悸发狂[2]。藏红花主要成分为番红花苦苷、番红花苷 I～II、藏红花醛、α-番红花酸，α-胡萝卜素、β-胡萝卜素等[3-5]。金黄地鼠具有血量充足、胆固醇耐受好、模型稳定、成本较低等优势，目前被普遍用于饮食性诱导的肥胖及高脂血症的研究[6-9]。本研究采用金黄地鼠作为试验动物，建立饮食性高脂血症金黄地鼠模型，给予不同剂量藏红花水提物，探讨藏红花水提物对高脂血症模型金黄地鼠肝脏保护作用。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF级健康雄性金黄地鼠60只，5周龄，体质量（80±5）g，购于北京维通利华生物科技有限公司，合格证号：SCXK（京）2016-0011；饲养于浙江中医大学动物实验研究中心，实验饲养室许可证号SYXK（浙）2013-0184，初始体质量差异均不显著。实验用基础饲料由动物实验中心提供，高脂饲料购自江苏省协同医药生物工程有限责任公司，配方为基础饲料68%，蔗糖10%，猪油10%，蛋黄粉10%，胆固醇2%。

1.2 药物与试剂 本实验所用藏红花水提液，由浙江中医药大学中药体外代谢实验室提供；TG试剂盒（批号4818UN18）、TC试剂盒（批号12061UN11）购自雅培制药有限公司；LDL-C试剂盒（批号9260099）、HDL-C 试剂盒（批号 92469095）、ALT 试剂盒（批号020334）、AST试剂盒（批号 010201）购自中生北控生物科技股份有限公司；辛伐他汀（规格：20mg×7片、批号H19990366）购自默沙东制药有限公司；PPAR-γ抗体购自Cell Signaling Technology公司；GAPDH抗体购自上海碧云天。逆转录试剂盒，定量PCR试剂盒购自QIAGEN公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PPAR-γ：上游引物：5’-CTGATGCTTTAACCCCACAGACTCGG-3；下游引物：5’-CCCTTTACCACAGTTGATTTCTCCAG-3；GAPDH：上游引物：5’-CATCACCATCTTCCAGGAGC G-3；下游引物：5’-GAGGGGCCATCCACAGTCTTC-3。

1.3 仪 器 全自动血脂生化分析仪（德国罗氏诊断有限公司）；Tecan酶标仪（瑞士）；荧光显微镜及图像采集系统（日本）；移液枪（德国 Eppendorf）；Milli-Q超纯水系统（Millipore公司，美国），Minispin离心机（eppendorf公司，德国），多功能酶标仪（TECAN公司，奥地利）；Chemi Scope 6300化学发光成像仪（上海勤翔科学仪器有限公司）。

2 方法

2.1 模型制备及分组给药 60只金黄地鼠适应性饲养观察1周，根据初始体质量，随机取8只金黄地鼠作为正常组，给予普通饲料，其余52只给予高脂饲料进行造模，造模时间4周，造模结束后对所有金黄地鼠进行血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）水平检测，当造模组金黄地鼠血清TC、TG水平较对照组有极显著性差异（P＜0.01）时，说明造模成功，同时剔除不符合造模标准的动物。

剔除后将造模成功的40只金黄地鼠按照随机数字表法分成五组，即模型组、藏红花水提液低、中、高（剂量分别为 5，10，20g·kg-1·d-1）剂量组及阳性药辛伐他汀（15mg·kg-1·d-1）组，每组 8 只。各给药组分别灌胃给予不同浓度药物，给药体积为2mL/100g，1d1次，连续给药4周，正常组和模型组灌胃给予等体积的生理盐水。正常组饲以普通饲料，其余组饲以高脂饲料，自由饮水进食。

2.2 指标检测 给药后每周测量2次体质量，第4周末统计摄食量，心脏取血，全自动生化仪测定血清TC，TG，高密度脂蛋白（HDL-C），低密度脂蛋白（LDL-C），丙氨酸氨基转氨酶（ALT），天门冬氨酸氨基转氨酶（AST）水平，并根据结果计算动脉粥样硬化指数（TG/HDL-C），冠状动脉指数（LDL-C/HDL-C）。

2.3 肝脏形态及病理学观察 处理各金黄地鼠，称取体质量，取肝组织、脂肪组织，称量肝组织质量。采用苏木精-伊红（HE）染色观察肝组织脂肪变化及炎症程度，油红O染色观察金黄地鼠肝脏组织脂质沉积情况，200倍光镜下观察。

2.4 脂肪组织过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR-γ）mRNA和蛋白表达 脂肪组织PPAR-γ mRNA表达采用Real-time PCR检测，以GAPDH为内参，相对表达量（2-ΔΔCt）值表示目的基因PPAR-γ的表达水平。Western blot法检测PPAR-γ蛋白表达，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，使用ImageJ进行灰度值计算。

2.5 统计学方法 应用GraphPad Prism 5.0软件处理数据，实验数据均以均数±标准差（s）表示，析用单因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 藏红花水提液对高血脂症金黄地鼠体质量的影响 给药开始时，各组金黄地鼠体质量无明显差异；随着实验的进程，模型组体质量呈现稳步增长趋势，而实验组（低、中、高剂量）均呈现增长较缓（见插页图1）。给药4周后模型组（饲喂高脂饲料）体质量显著高于正常组（饲喂基础饲料）（P＜0.01）。藏红花水提物低、中、高剂量组及阳性药组体质量较之模型组分别下降了9.3%、7.1%、12.4%、11.2%，而各组间摄食量无显著差异，见表1。

3.2 藏红花水提液对高脂血症金黄地鼠肝脏质量的影响 给药结束时，模型组金黄地鼠的肝脏质量及肝脏指数（肝重/体质量）明显高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.01）；藏红花低、中、高剂量组金黄地鼠的肝脏质量及肝脏指数均较模型组低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表 2。

表1 四周给药后各组金黄地鼠体质量及摄食量比较（g

表1 四周给药后各组金黄地鼠体质量及摄食量比较（g

注：与正常组比较，*P＜0.01；藏红花水提液低浓度组以 5g·kg-1·d-1浓度灌胃；中浓度组以10g·kg-1·d-1浓度灌胃；高浓度组以20g·kg-1·d-1浓度灌胃；阳性药组以15mg·kg-1·d-1辛伐他汀灌胃；正常组和模型组以等体积生理盐水灌胃

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表2 各组金黄地鼠肝脏质量比较（g

表2 各组金黄地鼠肝脏质量比较（g

注：与正常组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；藏红花水提液低浓度组以5g·kg-1·d-1浓度灌胃；中浓度组以10g·kg-1·d-1浓度灌胃；高浓度组以20g·kg-1·d-1浓度灌胃；阳性药组以15mg·kg-1·d-1辛伐他汀灌胃；正常组和模型组以等体积生理盐水灌胃

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3.3 藏红花水提液对高脂血症金黄地鼠血脂代谢的影响 给药4周后模型组金黄地鼠血清TG、TC、LDL-C水平，动脉粥样硬化及冠状动脉指数显著高于正常组（P＜0.01），而 HDL-C（高密度脂蛋白）含量显著低于正常组（P＜0.01）；与模型组相比，藏红花水提液中、高剂量组及阳性组血清TG、TC、LDL-C含量显著降低，藏红花水提液各剂量组及阳性组HDL-C水平较模型组显著增加，且动脉粥样硬化及冠状动脉指数显著降低（P＜0.01），见表 3。

3.4 藏红花水提液对高脂血症金黄地鼠血清AST、ALT水平的影响 给药结束时，模型组金黄地鼠血清ALT、AST 水平较正常组显著升高（P＜0.05），表明模型组金黄地鼠肝脏受损明显；与模型组比较，藏红花水提液中、高剂量组及阳性组均能显著降低血清AST水平（P＜0.01），藏红花水提液高剂量组及阳性组可显著降低血清ALT水平（P＜0.05），差异有统计学意义，见表4。

3.5 藏红花水提液对高脂血症金黄地鼠肝脏组织形态及脂滴沉积的影响 采用HE（苏木精-伊红）染色观察肝脏组织形态变化，正常组金黄地鼠的肝组织完好，肝细胞排列整齐，胞间界限清晰，胞浆内未见脂肪样空泡；模型组金黄地鼠肝细胞肿胀，胞间界限不清，胞质内可见脂滴空泡；藏红花水提液低、中、高三个剂量的藏红花水提液均能使金黄地鼠肝组织结构，脂滴空泡等情况有不同程度的改善，见插页图2。

表3 各组金黄地鼠血清TG、TC、HDL-C及LDL-C含量比较（mmol/L

表3 各组金黄地鼠血清TG、TC、HDL-C及LDL-C含量比较（mmol/L

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；TG：甘油三酯；TC：总胆固醇；HDL-C：高密度脂蛋白；LDL-C：低密度脂蛋白；藏红花水提液低浓度组以 5g·kg-1·d-1浓度灌胃；中浓度组以 10g·kg-1·d-1浓度灌胃；高浓度组以 20g·kg-1·d-1浓度灌胃；阳性药组以 15mg·kg-1·d-1辛伐他汀灌胃；正常组和模型组以等体积生理盐水灌胃

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表4 各组金黄地鼠肝功能指标比较（U/L

表4 各组金黄地鼠肝功能指标比较（U/L

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；AST：天门冬氨酸氨基转氨酶；ALT：丙氨酸氨基转氨酶；藏红花水提液低浓度组以 5g·kg-1·d-1浓度灌胃；中浓度组以 10g·kg-1·d-1浓度灌胃；高浓度组以 20g·kg-1·d-1浓度灌胃；阳性药组以 15mg·kg-1·d-1辛伐他汀灌胃；正常组和模型组以等体积生理盐水灌胃

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表5 各组金黄地鼠脂肪组织PPAR-γ比较，n=3）

表5 各组金黄地鼠脂肪组织PPAR-γ比较，n=3）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；过氧化物酶体增殖物激活受体 γ（PPAR-γ）；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶；藏红花水提液低浓度组以5g·kg-1·d-1浓度灌胃；中浓度组以10g·kg-1·d-1浓度灌胃；高浓度组以20g·kg-1·d-1浓度灌胃；阳性药组以15mg·kg-1·d-1辛伐他汀灌胃；正常组和模型组以等体积生理盐水灌胃

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采用油红O染色观察金黄地鼠肝脏组织中脂质的沉积情况，正常组肝脏未见明显脂滴沉积，模型组肝脏可见明显脂滴沉积，呈弥漫性；与模型组相比较，藏红花水提液各剂量均可见肝脏脂滴沉积减少，且高剂量组较之其他两个剂量组脂滴沉积明显减少，见插页图3。

3.6 藏红花水提液对高脂血症金黄地鼠脂肪组织PPAR-γ影响 给药后模型组脂肪组织PPAR-γ蛋白相对表达较正常组显著降低（P＜0.01），藏红花水提液干预后，中、高剂量组以及阳性组肝组织PPAR-γ蛋白表达较模型组显著增加（P＜0.05）。给药后，与正常组相比，模型组PPAR-γ mRNA水平显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，藏红花水提液各剂量组及阳性组PPAR-γ mRNA表达水平具有不同程度增加，藏红花水提液高剂量组及阳性药组PPAR-γ mRNA水平增加明显，差异有统计学意义（P＜0.01），见表5、插页图4。

4 讨论

据报道，藏红花有降血脂、抗肿瘤、抗氧化、改善心肌缺血缺氧、保护BPA（双酚A）或者氧化应激导致的肝损伤等作用，但对于饮食性高脂血症的肝脏保护作用鲜有报道[10-18]。本研究中，藏红花水提液干预组体质量增长较模型组缓慢，肝脏质量及肝脏指数均较模型组低，而肝脏指数常用于评价肝脏脂肪变性程度，从HE和油红O的染色结果也可以得出结论，藏红花水提液干预后，高脂血症金黄地鼠肝脏脂肪变性程度与脂滴沉积得以缓解。

与此同时，与模型组相比，藏红花水提液（中、高剂量）血清TG、TC、LDL-C含量较模型组显著降低，且动脉粥样硬化指数和冠状动脉指数较模型组显著降低（P＜0.05），同时显著提高血清 HDL-C 含量（P＜0.05），表明藏红花水提液可调节高脂血症金黄地鼠的血脂水平。Asdaq等[10]通过给高脂血症大鼠灌胃（ig）藏红花提取液 25、50、100mg·kg-1，发现藏红花及其藏红花素可以通过抑制自由基，显著减缓高脂血症大鼠血脂代谢紊乱现象，与本实验结果具有一致性。

AST和ALT是反映肝功能异常的重要指标。与模型组金黄地鼠相比，高剂量藏红花水提液可降低血清中AST和ALT水平（P＜0.05），表示藏红花水提液可能具有减轻高脂血症金黄地鼠肝脏损伤的作用。

过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）是一类受过氧化物酶体增殖物激活的核受体，在脂质代谢中发挥着重要作用。PPAR-γ多存在于脂肪组织中，通过调控调节相关基因的表达影响糖脂代谢和脂肪形成等过程[19-21]。藏红花水提液干预后，金黄地鼠脂肪组织PPAR-γ mRNA水平与蛋白表达较之模型组均显著提高（P＜0.01）。

综上所述，藏红花水提液对于高脂血症金黄地鼠的肝脏保护作用体现藏红花水提液不仅调节血清内血脂水平，且降低了金黄地鼠血清内天门冬氨酸氨基转氨酶和丙氨酸氨基转氨酶水平，改善肝脏组织脂肪变性和脂滴沉积。同时，藏红花水提液干预后，金黄地鼠脂肪组织PPAR-γ mRNA和蛋白水平均有所提高，这可能是藏红花改善高脂血症金黄地鼠血脂水平，发挥肝脏保护作用的机制之一。