建立以HIF-1α为靶标的高通量筛选防治动脉粥样硬化先导化合物的细胞模型

钱俞君, 秦春霞, 孙莉莉, 丁华敏, 李铁军

(上海市浦东新区浦南医院药剂科,上海 200125)

动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是多种心脑血管疾病共同的病理学基础，主要发病机制包括血管内皮损伤、慢性炎症反应、氧化应激、泡沫细胞形成等[1]。缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor-1, HIF-1)与缺氧、炎症、泡沫细胞形成、氧化应激等众多AS致病因素密切关联，提示HIF-1可能是AS发生发展的重要靶标和开发防治AS的药物新靶点。本研究将建立一个以荧光素酶活性检测反映HIF-1α活性变化为观测指标，高通量筛选抗AS先导化合物的体外细胞模型，并通过阳性药洛伐他汀及姜黄素的抗HIF-1α活性检测分析对该模型进行验证。

1 材料与方法

1.1 实验材料和设备

人单核巨噬细胞系U937和THP-1系购自上海中科院细胞所；RPMI-1640培养基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、Lipofectamine2000转染试剂和Trizol等(Invitrogen公司)；pGL3-Enhancer荧光素酶表达载体、双荧光素酶活性检测系统购自美国Promega公司；无内毒素质粒DNA制备试剂盒购自Qiagen公司；蛋白一抗及二抗(Abcam公司)，细胞培养箱(美国Nuaire公司)，定量PCR仪及配套检测试剂盒(Takara公司)；DNA合成及测序在上海Invitrogen公司完成，洛伐他汀和姜黄素购自Sigma公司。

1.2 实验方法

1.2.1载体构建

文献查阅HRE核心序列信息为5′-(A/G)CGT (G/C) C-3′，根据核心序列，设计长链互补双链引物，为核心序列的7组重复序列，引物两端添加KpnI和XhoI酶切位点及保护碱基。上游引物：5′-GGGGTACCACGTGCACGTGC ACGTGCACGTGCACGTGCACGTGCACGTGCCGG-3′；下游引物：5′-CCGCTCGAGGCACGTGCACGTGCACGT GCACGTGCACGTGCACGTGCACGTCC-3′。引物设计完成之后，按照Page级进行合成。后将双链DNA稀释退火形成双链DNA，克隆至线性化的表达载体pGL3-Enhancer，构建荧光素酶重组表达载体pGL3-HIF-1α。重组载体经过序列分析确认无误后，扩增转化菌株，使用Qiagen的无内毒素质粒DNA抽提试剂盒制备无内毒素质粒DNA。

1.2.2细胞转染及工具细胞株筛选

取对数生长期U937和THP-1细胞，使用完全培养基(RPMI-1640+10%FBS)调整细胞浓度为1×105个/ml，将细胞接种到6孔板，每孔添加2 ml细胞悬液，37 ℃和5%CO2浓度下培养24 h，按照转染试剂Lipofectmaine 2000说明书进行pcDNA-GFP质粒转染实验。转染后72 h，荧光倒置显微镜下观察两组细胞转染效率。

1.2.3稳定表达细胞株筛选

以转染效率高的THP-1细胞进行稳定表达细胞株筛选试验。将THP-1细胞(1×105个/ml)接种到6孔板培养24 h后，进行pGL3-HIF-1α-HRE质粒转染。转染后48 h，使用台酚蓝进行活细胞染色，制备细胞悬液(10个/ml)后接种细胞至96孔细胞培养板，正常条件(37 ℃和5%CO2)继续培养，每3 d换液，培养至第9天。倒置显微镜下观察，选择细胞形态均一的6个细胞克隆(标记为C1～C6)后转移至24孔板继续培养，再放大培养至12孔板，直至6孔板和10 cm培养皿。然后通过基因筛查的方法对其中的克隆片段HIF-1α-HRE进行定量，根据检测结果选取其中1株克隆进行后续实验。

1.2.4RealTime-PCR检测细胞克隆中HRE相对含量

取对数生长期的6组克隆细胞各1×106个，按照Trizol说明书，提取细胞总RNA，使用通用反转录引物Random9并参照试剂盒说明进行反转录制备cDNA，然后进行定量PCR反应。检测引物序列：β-actin上游引物：5′-AACCCTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3′,β-actin下游引物：5′-CGACCAGAGGCATACAGGGACAAC-3′; HRE上游引物：5′-GGGGTACCACGTGCACGTGCA-3′, HRE下游引物：5′-CCGGCACGTGCACGTGCACGTGCA-3′，β-actin为内参使用。PCR的反应总体系为20 μl：SYBR Premix Ex Tap 10 μl，上下游引物(20 μmol/L)各0.2 μl，cDNA 2 μl。PCR反应条件：95 ℃，10 min；60 ℃，20 min；72 ℃，20 min，反应设置为40个循环。通过扩增曲线与阈值线的交点来计算每组样本的Ct值，目的基因相对于内参基因的表达量为2ΔΔCt。根据定量结果，选取HRE表达最高的一株细胞克隆，命名为THP-1-HIF-1α-HRE-Luciferase进行后续实验。

1.2.5荧光素酶报告基因实验

取对数生长期THP-1-HIF-1α-HRE-Luciferase细胞，使用完全培养基制备细胞悬液，接种细胞到96孔细胞培养板，正常条件培养24 h，使用完全培养基进行全量换液，同时添加洛伐他汀(10 μmol/L)和姜黄素(1、2和10 μmol/L)，正常条件培养2 h后，细胞转入低氧条件(95% N2和5% CO2)继续培养24 h。而后收集细胞，分别检测各组细胞荧光素酶活性和HIF-1α蛋白表达。

1.2.6免疫印迹法检测HIF-1α蛋白表达

离心法收集待测细胞，提取细胞总蛋白，BCA法检测总蛋白浓度。每组样本取11 μl进行10% SDS-PAGE垂直电泳，湿法将胶中蛋白水平转移至PVDF膜上，5%的脱脂牛奶常温封闭2 h，加入TBST稀释后的一抗(HIF-1α一抗，1∶500，β-actin一抗，1∶1 000稀释)，4 ℃过夜；取出后TBST洗膜3次再加入二抗(羊抗鼠二抗，1∶3 000稀释)，孵育2 h，再洗膜3次，添加化学发光反应底物，进行X光曝片，目的条带经扫描后通过光密度分析软件进行分析，Twist蛋白相对含量=目的条带的光密度值/β-actin条带的光密度值。

1.2.7统计学处理

2 结果

2.1 pGL3-HIF-1α-HRE表达载体构建

载体经序列分析(图1)，插入HRE序列与设计序列完全一致。

2.2 工具细胞株筛选

质粒转染后72 h，笔者发现THP-1细胞的转染效率(GFP表达细胞占所有细胞的比例)远远大于U937(图2)。细胞的转染效率是稳定表达细胞株筛选和建立的前提。同时，THP-1细胞增殖旺盛，细胞大小形态更为均一，因此，选择THP-1进行后续稳定表达细胞株的筛选，即工具细胞株建立。

图2 U937和THP-1细胞转染后72 h细胞转染效率检测A、C.为可见光下拍照；B、D.为相同视野下的可见光视野

2.3 细胞克隆鉴定

通过荧光定量的方法对形态学初步筛选的6组克隆细胞(C1～C6)中外源基因HIF-1α-HRE序列做了定量分析以选择高质量细胞进行克隆。结果(图3)表明，6组克隆细胞中均有外源基因HIF-1α-HRE检出，其中C1克隆的外源基因相对含量最低，C2最高。与C1比较，C2、C4和C5组克隆HIF-1α-HRE相对含量均明显升高，且差异具有统计学意义(P<0.05)。因此，选择C2号克隆(命名为THP-1-HIF-1α-HRE-Luciferase)进行后续实验。

图3 HIF-1α-HRE的定量检测*P<0.05，**P<0.01， 与C1组比较A.HIF-1α-HRE相对含量的组间差异分析；B.Realtime-PCR检测原始曲线

2.4 THP-1-HIF-1α-HRE-Luciferase细胞的荧光素酶活性检测

THP-1-HIF-1α-HRE-Luciferase经24 h低氧培养，与溶媒对照组比较，胞内荧光素酶活性明显增强(P<0.01)。洛伐他汀(10 μmol/L)预处理2 h，可以有效抑制低氧引起的THP-1-HIF-1α-HRE-Luciferase细胞荧光素酶升高，与低氧组比较差异有统计学意义(P<0.01)。姜黄素(1、2和10 μmol/L)预处理也可有效抑制低氧引起的荧光素酶升高，其中2 μmol/L和10 μmol/L预处理组与低氧组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。

图4 THP-1-HIF-1α-HRE-Luciferase细胞荧光素酶活性检测*P<0.05，**P<0.01，与低氧组比较

2.5 THP-1-HIF-1α-HRE-Luciferase细胞的HIF-1α蛋白表达检测

低氧培养24 h能够明显增强THP-1-HIF-1α-HRE-Luciferase细胞内HIF-1α表达，与溶媒组比较差异有统计学意义(P<0.01)。洛伐他汀(10 μmol/L)和姜黄素(1、2和10 μmol/L)均可抑制低氧引起的THP-1-HIF-1α-HRE-Luciferase细胞内HIF-1α表达增强，与低氧组比较差异有统计学意义(P<0.01 )。结果与荧光素酶活性的结果相一致(图5)。

图5 免疫印迹检测THP-1-HIF-1α-HRE-Luciferase细胞HIF-1α蛋白表达*P<0.05，**P<0.01，与低氧组比较

3 讨论

AS是一个由动脉血管壁粥样斑块进行性积聚，最终导致局灶性动脉阻塞的病理过程。天然物质中尤其是中药中有许多成分如黄酮类，通过抗氧化作用抑制泡沫细胞形成和AS的发生[2]。从中药及其提取物、单体成分中筛选抑制泡沫细胞形成的活性成分可能是一条可行的便捷途径，因此建立高通量和特异的筛选模型是十分重要的课题。报告基因法筛药模型就是针对靶基因表达调控发展起来的功能性新药高通量筛选方法，即将靶基因表达的调控序列与编码某些酶活性(如荧光素酶)的基因相连，转入细胞内，通过简单地检测酶活性(如荧光强度)变化，来反映化合物对转录因子和靶基因表达的作用性质和强度。

HIF-1是由α亚基和β亚基组成的异二聚体，其中HIF-1α蛋白是HIF-1DNA结合活性的主要决定因素，通过与HRE结合调控相应基因的表达。HIF-1在缺氧适应和许多病理过程中(如肿瘤、心肌缺血、肺动脉高压和慢性阻塞性肺疾病等)起重要作用[3]。研究表明缺氧在AS发生、发展中起重要作用，而HIF-1是缺氧诱导基因表达的中心调节子[4-5]。AS是一个慢性炎症过程[1]，包括细胞因子、黏附分子产生、氧化应激、泡沫细胞形成等，而HIF-1是炎症细胞功能的关键调节因子[6]。有报道高胆固醇低密度脂蛋白通过诱导HIF-1α高表达促进内皮细胞VEGF和VEGF受体-2过度表达[7]；而维生素C和维生素E等抗氧化剂通过降低HIF-1α表达从而抑制VEGF和VEGF受体-2上调，是其抗AS的机制之一[8-9]。Shatrov 等[10]报道氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)通过氧化还原调节途径引起人巨噬细胞HIF-1α蛋白积累。本课题组应用体外ox-LDL诱导人单核细胞株U937形成泡沫细胞模型，发现RNA干扰HIF-1α可显著抑制泡沫细胞形成，抑制许多AS相关基因表达[11]。综上可见，HIF-1α是泡沫细胞和AS形成的重要靶标，针对HIF-1靶点可研发防治AS的药物。有报道从天然植物提取物中针对肿瘤细胞HIF-1α为靶点采用报告基因法筛选了HIF-1抑制物[12]。但未见针对单核细胞中HIF-1α为靶点的中药活性成分筛选的报道。

羟甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂他汀类药物是临床上疗效确切的调血脂药和抗AS药，目前研究表明他汀类药物在不降低高脂血症血浆脂蛋白情况下，可下调人血管内皮细胞和平滑肌细胞HIF-1表达，减轻冠状动脉壁缺氧和滋养血管生成[13-14]。芹菜素和姜黄素等天然化合物通过降解HIF-1α抑制VEGF表达从而抑制血管生成[15]。本研究中采用洛伐他汀和姜黄素作为阳性对照药物，观察对模型体系中HIF-1α表达的抑制作用。

在本研究中，笔者首先构建含人HIF-1启动子即HRE特定部位和LUC的嵌合体报告基因质粒(pGL3-HIF-HRE-Luc)，进而转染巨噬细胞THP-1，通过单细胞培养法建立稳定表达细胞株THP-1- HIF-1α-HRE-Luc，即高效HIF-1α活性筛选模型。然后通过研究HIF-1α抑制物工具药洛伐他汀和姜黄素对筛选模型进行功能鉴定。课题组针对泡沫细胞HIF-1α采用报告基因法建立了高通量细胞筛药模型，该模型为研发防治AS的新药提供了有利工具。