啤酒花HPLC指纹图谱研究

董志敏，许月明，闻 俊，蒋益萍，秦路平,,辛海量

(1.上海师范大学生命与环境科学学院，上海 200234；2.海军军医大学药学院，上海 200433；3.浙江中医药大学药学院，浙江 杭州 310053)

啤酒花HumuluslupulusL.是桑科葎草属多年生草质蔓生藤本植物，雌性球穗花序不仅作为酿造啤酒的重要添加原料，也广泛作为药物应用，具有止咳化痰、健胃、消食、安神、利尿之功效，用于缓解食欲不振、腹胀、失眠、肺结核、癔病、浮肿、膀胱炎等症状[1]。在我国，啤酒花被作为民族药(中药)收录于《哈萨克药物志》、《内蒙古植物药志》、《宁夏中药志》、《新疆药用植物志》、《四川中药志》等，为药食两用的新疆特色资源植物，同时，在黑龙江、山东等地也有啤酒花栽培[2]。目前在欧洲，啤酒花提取物用于缓解更年期的潮热不适以及绝经后骨质疏松症[3]。据文献报道，啤酒花含有木脂素、黄酮、多酚以及挥发性成分，其中，木脂素中的α酸、β酸，黄酮中的黄腐酚广受业界关注，大量研究证明其具有抗骨质疏松作用[4-5]。综观啤酒花指纹图谱研究，目前对啤酒花指纹图谱研究甚少，要想对啤酒花进行系统的质量评价，区分啤酒花栽培种与野生种，须对啤酒花进行系统的指纹图谱研究。因此，本实验采用HPLC指纹图谱，研究了26批新疆不同产地、品种啤酒花的指纹图谱(表1)，并对啤酒花中的7种主要成分进行了指认。本方法简单、方便、准确、高效，可用于啤酒花的质量评价。

表1 啤酒花样品产地来源及相似度

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津 LC-20AD高效液相色谱仪(配有四元梯度系统，PDA检测器)；色谱柱Diamonsil C18柱(250 mm × 4.6 mm,5 μm)；LC-solution色谱工作站。AG285型电子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)。DL-1000B 智能超声波清洗机(上海之信仪器有限公司)。

1.2 试剂

黄腐酚(CAS：6754-58-1，纯度≥98%，上海历鼎生物技术有限公司)；啤酒花浸膏ICE-3(美国酿造化学家协会)：包含类葎草酮、葎草酮、加葎草酮、类蛇麻酮、蛇麻酮、加蛇麻酮。色谱乙腈(Damas-beta有限公司)，色谱甲醇(Damas-beta有限公司)，分析磷酸(国药集团化学试剂有限公司)。

1.3 药材

啤酒花样品由王果平于2017年采集于新疆不同地方(表1)，并经海军军医大学药学院生药学教研室辛海量副教授鉴定，密封存放于干燥阴凉处。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱Diamonsil C18柱(250 mm × 4. 6 mm,5 μm)；流动相：0.1%磷酸水(A)-乙腈(B),梯度洗脱(0～10 min，20%～25%B；10～12 min，25%～75%B；12～30 min，75%～78%B；30～40 min，78%～81%B；40～42 min，81%～83%B；42～60 min，83%～90%B);流速1.0 ml/min;柱压10.2 MPa，柱温30℃；检测波长358 nm；进样量10 μl。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取黄腐酚26.46 mg，置于100 ml容量瓶，加甲醇稀释至刻度线，摇匀，得黄腐酚对照品储备液；精密称取啤酒花浸膏(ICE-3)466.27 mg置于100 ml容量瓶，加甲醇稀释至刻度线，摇匀，得类葎草酮、葎草酮、加葎草酮、类蛇麻酮、蛇麻酮、加蛇麻酮对照品储备液。分别取上述对照品储备液适量，稀释适当倍数，过0.45 μm微孔滤膜，得对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

分别取26个不同产地的啤酒花，依次粉碎存放于26个存放袋中，置于阴凉处，分别等量称取0.5 g粉末，置于26个具塞锥形瓶中，加入50%乙醇20 ml，称重，超声处理30 min，凉至室温，再称重，用50%乙醇补足损失重量，滤除残渣，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1精密度试验

取同一供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，进行测定。结果显示，各共有峰相对保留时间RSD<1%，相对峰面积RSD<3%，表明该方法精密度良好。

2.4.2重复性试验

分别取同一批啤酒花样品适量，共6份，精密称重，按照“2.3”项方法制备供试品溶液，按照“2.1”项色谱条件进行分析。结果表明，各共有峰相对保留时间RSD<1%，相对峰面积RSD<5%，表明该方法重复性良好。

2.4.3稳定性试验

取同一批啤酒花样品适量，按照“2.1”项色谱条件分别于0、2、4、8、12、24 h进行分析。结果表明，各共有峰相对保留时间RSD<1%，相对峰面积RSD<5%，表明供试品在24 h内稳定性良好。

2.5 样品测定

取26批啤酒花样品，分别按“2.3”项制备供试品，按“2.1”项色谱条件进行测定，结果得到19个共有峰，并对其中的黄腐酚、类葎草酮、葎草酮、加葎草酮、类蛇麻酮、蛇麻酮、加蛇麻酮进行指认，对照品及啤酒花样品HPLC图谱如图1所示。

图1 对照品及啤酒花样品HPLC图谱A.黄腐酚对照品；B.啤酒花浸膏(ICE-3)对照品；C.啤酒花样品；9.黄腐酚；13.类葎草酮；14.葎草酮；15.加葎草酮；17.类蛇麻酮；18.蛇麻酮；19.加蛇麻酮

2.6 啤酒花指纹图谱的建立

2.6.1内参比峰的选择

在各批次的指纹图谱中，13号峰为啤酒花中主要成分类葎草酮，保留时间适中，分离度良好，且面积大，为共有峰，确定为内参比峰。

2.6.2系统聚类分析

将26批啤酒花样品各色谱峰峰面积相对于称样量量化处理，得到26×19矩阵信息，用SPSS 20统计软件对其进行系统聚类分析，采用欧氏距离进行聚类分析，以化学距离为2.5，可以将26个样品分为5类。聚类分析结果如图2所示。

图2 系统聚类分析树状图

2.6.3共有模式的建立

采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”对26批啤酒花样品的HPLC指纹图谱进行数据分析处理，将S1作为参照图谱，选取“时间窗宽度”为0.1 min，以平均数的方法生成啤酒花共有模式的指纹对照图谱。计算不同样品与对照品的相似度如表1所示，啤酒花指纹图谱见图3。

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

啤酒花供试品的HPLC的3D图像显示，在358 nm检测波长下有较好吸收，基线平稳，各峰型较好，出峰数量也较多，因此选定检测波长为358 nm。本研究考察了甲醇-0.1%磷酸水系统和乙腈-0.1%磷酸水系统，发现乙腈-0.1%磷酸水系统分离效果较好。故选定乙腈-0.1%磷酸水作为流动相进行梯度洗脱，能达到较好的分离。

3.2 系统聚类分析与指纹图谱相似度评价

图3 26批不同产地啤酒花样品指纹图谱

由聚类分析树状图可以看出，26批啤酒花样品以化学距离为2.5，可分为5类。第一类又细分为3组，均为栽培种，第二类均为野生种，第三类均为栽培种，包含萨斯特和扎一品种；第四类为焉耆县的栽培种，第五类为栽培种，含有马可波罗栽培品种。由聚类分析结果可以看出，野生种和栽培种化学成分含量差异明显，野生种可以单独聚成一类，栽培种之间不同品种的化学成分含量差异较大，栽培种其不同的品种也可以单独聚类。在相似度评价中，相似度≤0.900的5批啤酒花均为野生种啤酒花。经系统聚类和相似度评价分析可以得出，啤酒花化学成分含量与栽培品种和野生种的关系密切。

综上所述，本实验建立了啤酒花HPLC指纹图谱，可为今后控制啤酒花的质量提供理论依据。