玉屏风多糖组分对皮肤角质形成细胞的作用研究

黄 瑾，刘景雪，曾 颖

(1.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院药学部，上海 200437；2.上海市浦东新区人民医院药剂科，上海 201299)

皮炎(dermatitis)是指由各种内、外部感染或非感染性因素导致的皮肤炎症，其病因和临床表现复杂多样，且反复发作，临床治疗较为困难。以最常见的特应性皮炎(atopic dermatitis，AD)为例，它是一种慢性的、反复发作的炎症性皮肤病，常伴有剧烈瘙痒，严重影响患者的生活质量[1-3]。随着对AD免疫病理机制研究的不断深入，治疗AD的疗法或药物主要包括：免疫抑制剂环孢素A、霉酚酸酯、白三烯拮抗剂孟鲁司特，针对CD11a、CD20、TNF-α或IgE的单克隆抗体，γ-干扰素以及静脉注射免疫球蛋白等。上述药物在临床试用中均已显示对AD具有一定疗效，但由于副作用大或价格昂贵等原因使应用受到限制。

近年来有文献报道，中医经典方剂玉屏风散对治疗包括AD在内的多种皮炎有确切效果[4-7]。玉屏风散出自我国元代医学家危亦林的中医名著《世医得效方》，由黄芪、白术、防风三味中药组成，临床上将玉屏风散作为中药免疫调节剂加以使用。多糖组分是玉屏风散发挥免疫干预作用的主要有效部位，能够增强机体非特异性免疫和黏膜免疫功能。但多糖组分是否在玉屏风散治疗皮肤疾病中发挥主要作用，对在皮炎形成发展过程中有重要作用的皮肤角质形成细胞是否有免疫调节作用，目前尚未见报道。本研究分离提取了玉屏风的多糖组分，探讨其在体外对皮肤角质形成细胞的免疫调节作用，阐明玉屏风多糖组分的活性作用，为其进一步用于皮炎的临床治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株与载体

人皮肤角质形成细胞(keratinocytes，KCs)株HaCaT细胞(中科院上海细胞所)，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基常规传代培养。

1.2 试剂与仪器

DMEM培养基(Gibco公司)，胎牛血清(Hyclone公司)。LPS (E.coli ,O111∶B4 )、辣椒素(capsaicin，CAP，Sigma-Aldrich公司)；TNF-α(美国PeproTech公司)；聚角蛋白微丝蛋白(Filaggrin)的Elisa检测试剂盒(武汉伊艾博科技有限公司)；IκBα、P65抗体及磷酸化抗体(Cell Signaling Technology，CST)。玉屏风散由黄芪、白术、防风三味中药按3∶1∶1组成。实验中将玉屏风组分进行拆方研究，获取黄芪多糖(APS)、白术多糖(PAM)、防风多糖(SPS)、玉屏风总水煎物(YPF)和玉屏风总多糖(TP)，均由江苏永健医药有限公司提供。

1.3 玉屏风各组分对皮肤角质形成细胞表达炎

症因子的影响

HaCaT细胞按常规培养并分入6孔板，培养过夜。加入YPF、APS、PAM、SPS及TP，终浓度均为200 μg/ml。处理30 min后，再加入终浓度为10 μg/ml的LPS培养24 h，收集细胞，提取RNA，用Real-time PCR法检测相关趋化分子和细胞炎症因子mRNA表达水平，合成的引物序列见表1。

Real-time PCR实验条件设置如下，50℃：2 min，95℃：10 min；95℃：15 s，60℃：1 min，40个循环。样品的半定量比较按以下公式计算：

ΔCt=目的基因Ct-GAPDH Ct。

表1 用于Real-time PCR的各引物序列

1.4 玉屏风各组分对Filaggrin表达的影响

HaCaT细胞按常规培养并分入6孔板，加入各中药组分处理30 min，再加入刺激剂辣椒素(capsaicin，CAP)10 μmol/L培养24 h，收集细胞和培养上清液，提取RNA，分别采用Real-time PCR法检测Filaggrin的mRNA(引物序列见表1)表达水平，用Elisa法检测细胞培养上清液中的蛋白表达水平。

1.5 玉屏风各组分对炎症相关信号通路NF-κB的影响

HaCaT细胞分别与YPF、APS及TP(200 μg/ml)预孵育2 h，用10 ng/ml的TNF-α刺激20 min，收集细胞，裂解蛋白。用Western blot检测NF-κB通路中IκB的磷酸化及降解，以及P65的磷酸化水平，来表示这些组分对TNF-α诱导的NF-κB通路活化的影响。

1.6 统计学处理

用软件SPSS 18进行独立样本t检验统计分析，当P<0.05时，认为差异有统计学意义。

2 玉屏风各组分的作用结果

2.1 抑制HaCaT细胞中炎症因子mRNA表达水平

玉屏风散多个组分均对LPS刺激的HaCaT细胞中炎症细胞因子IL-1β、IL-8和趋化分子MCP-1的表达有抑制作用(图1)。其中APS、YPF和TP对炎症细胞因子白介素(IL)-1β抑制率分别为36.2 %、47.7 %和49.3%；TP对IL-8和趋化分子MCP-1的抑制率最高，分别为105.5 %和61.7%，具有显著的统计学差异(P<0.05)。

图1 玉屏风各组分对LPS刺激的HaCaT细胞中炎症因子mRNA表达水平的影响(n=3) A.IL-1β相对表达量；B.IL-8相对表达量；C.MCP-1相对表达量

2.2 对Filaggrin表达的影响

Real-time PCR实验结果表明(图2A)，与CAP组比较，YPF、APS、PAM和TP对Filaggrin的mRNA表达均有促进作用，可分别增加84.5%、33.1%、47.9%和67.6%。同时，Elisa实验结果(图2B)表明，与CAP组比较，YPF、APS和TP对Filaggrin的蛋白表达均有促进作用(P<0.05)，提示其对皮肤有较好的保护作用，而PAM组未表现出明显差异。

图2 玉屏风各组分对KCs株HaCaT细胞中Filaggrin表达的影响(n=3) A.Real-time PCR实验结果；B.Elisa实验结果*P<0.05，与空白组比较；#P<0.05，与CAP组比较

2.3 对NF-κB信号通路的影响

NF-κB信号通路是炎症和免疫细胞的共同活化通路。在前期工作的基础上，选择YPF、APS和TP(200 μg/ml)，检测其对TNF-α诱导的NF-κB通路的影响。NF-κB常见的形式是由p50和p65蛋白亚基组成异源二聚体，在静息状态时与其抑制物IκB结合以无活性的复合物形式存在于细胞浆，当细胞受到外来刺激时，通过一系列信号转导途径，激活系列激酶使IκB降解从而释放NF-κB，使其从细胞浆移位到细胞核，并在胞核内与相应基因上的结合位点发生特异性的结合，调控炎症细胞因子、趋化因子、黏附分子等相关基因的表达，参与调控机体的免疫反应和炎症反应。Western blot结果表明(图3)，YPF、APS和TP 3种组分均具有显著抑制HaCaT细胞中NF-κB通路活化的作用，其中以TP作用最强。

图3 玉屏风各组分对TNF-α诱导的HaCaT细胞中NF-κB通路活化的影响

3 讨论

AD表现为明显的湿疹样变和皮肤干燥，病程迁延难愈，易反复发作，瘙痒难忍，常影响情绪和睡眠，被医学界视为“湿疹中最难治的一种”。AD是一种双相型T细胞介导的疾病，而KCs、朗格罕氏细胞(Langerhans cells，LCs)和炎症性表皮树突状细胞(inflammatory dendritic epidermal cells，IDECs)在炎症因子分泌和抗原递呈激活T细胞的过程中发挥重要作用。KCs既是皮肤屏障功能的重要执行者，也是免疫应答的积极参与者，其生物学功能以往被大大低估。KCs还是各种趋化因子和细胞因子的重要分泌细胞，进一步研究其免疫功能将有助于对AD发病机制的理解和开发新的治疗策略。

AD的药物研发一直受到广泛关注。传统治疗方法(使用激素、抗组胺药、抗炎药等)可以暂时缓解症状，但停药后往往复发，且病情加重，甚至转为慢性。外用糖皮质激素由于作用迅速且疗效显著，常用于AD治疗。然而这类药物长期外用可能引起皮肤萎缩、毛细血管扩张、色素沉着、口周皮炎以及继发感染等不良反应。玉屏风散方中黄芪益气固表止汗为君；白术补气健脾为臣；佐以防风走表而散风邪，合黄芪、白术以益气祛邪。且黄芪得防风，固表而不致留邪；防风得黄芪，祛邪而不伤正，有补中寓疏，散中寓补之意。黄芪中含有多糖、蛋白质、生物碱、氨基酸、黄酮类、微量元素等活性物质，其中多糖成分的免疫活性最为突出[8]。APS从黄芪中提炼得到，是黄芪的主要生物活性成分。早在20世纪90年代，有日本学者研究发现，黄芪多糖具有增强老龄鼠产生抗体的作用[9]。PAM作为白术的一个重要组成成分，具有毒性小、生物利用度高、药理作用明确等特点[10]，已经用于食品添加剂，并作为临床药物用于恢复期肿瘤患者或在化疗时辅助应用，目前已经证明其有明显的增强免疫作用。防风亦具有增强免疫作用，其有效部位为多糖，SPS具有增强免疫活性，能明显增加体外培养的巨噬细胞释放IL-1和IL-8，提高NK细胞和脾淋巴细胞的杀伤活性，促进IL-2对NK细胞的激活[11]；还有研究表明SPS呈剂量依赖性地提高小鼠特异性免疫和细胞免疫功能，还能促进小鼠脾淋巴细胞的增殖。

由KCs分泌的一种被称为Filaggrin的分子是构成皮肤屏障功能的重要成分[12]。AD患者皮肤Filaggrin表达减少是导致皮肤屏障功能缺陷的重要原因，而皮肤屏障功能缺陷则使环境中的蛋白抗原、微生物和其他刺激原易于通过表皮层，进而刺激局部免疫细胞，触发Ⅰ型和Ⅳ型变态反应，这是启动皮肤炎症的主要环节。为了进一步考察玉屏风各组分对皮肤的保护作用，笔者验证了其对Filaggrin表达的影响(该蛋白表达上调可能促进真皮屏障功能的恢复)。

笔者对玉屏风散的多糖组分对皮肤角质形成细胞的免疫调节功能进行了研究，发现APS和TP都有明显的免疫调节作用，以后者的作用更为显著。TP可以抑制激活的皮肤角质形成细胞分泌炎症介质，促进Filaggrin的表达，并对炎症和免疫细胞的活化具有重要作用的NF-κB信号通路有明显的抑制作用。这些基础研究为进一步开发利用中药方剂玉屏风用于AD的治疗阐明了作用机制，打下了良好的基础。