车前草中大车前苷的含量测定及提取工艺优选

吕 昂，范 新，苏 倩，俞文英，余陈欢

(1.杭州市第一人民医院药学部，浙江 杭州 310006；2.杭州市妇产科医院药学部，浙江 杭州 310008；3.浙江省医学科学院，浙江 杭州 310013)

车前草又名车前、猪耳草、车轮菜、钱串草等，为车前科植物车前PlantagoasiaticaL.或平车前PlantagodepressaWilld.的干燥全草。作为临床常用中药，车前草具有清热利尿、渗湿通淋、止咳化痰、凉血、解毒等功效，用于热淋涩痛、水肿尿少、暑湿泄泻、痰热咳嗽、吐血衄血及痈肿疮毒等[1-2]。

车前草的化学成分主要包括环烯醚萜、黄酮、苯乙醇苷、多糖等[3-5]。文献报道车前草中的苯乙醇苷类成分(如大车前苷)具有抑制糖基最终产物形成[6]、抗氧化[6]、抗炎[7]、解痉[8]等作用，与车前草的功效相吻合，同时，大车前苷为车前草的专属性成分，在车前草中含量较高，为车前草质量控制的指标性成分。本实验采用HPLC法测定车前草中大车前苷的含量[1]，并对影响提取车前草的因素进行了考察，通过正交试验优选出最佳提取工艺，为将其研发为中药新药提供技术支持。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-20AT高效液相色谱仪(配备LC-20AT泵、柱温箱、SPD-20A紫外检测器、SIL-20AC自动进样器、LCsolution色谱工作站，日本岛津公司)，Dikma微孔滤膜(0.45 μm)、Sartorius BT125s型电子分析天平(德国赛多利斯公司)，BUCHI R-210旋转蒸发仪(瑞士步琦有限公司)，DK-S22型恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)，Beckman Coulter 64R高速离心机(贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司)。

1.2 试药

大车前苷标准品(纯度>98%，批号：20141202，南京春秋生物工程有限公司)，车前草(批号：150301，浙江中医药大学中药饮片有限公司)，乙腈、甲醇、甲酸为色谱纯(德国Merck公司)，水为纯化水，磷酸等其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 含量测定方法的建立

2.1.1色谱条件

色谱柱：DiamonsilTMC18分析柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流动相：乙腈-0.1%甲酸水溶液(16∶84)；检测波长：330 nm；流速：1.0 ml/min；柱温：30℃；进样量：20 μl；理论塔板数以大车前苷峰计不低于3 000，大车前苷与相邻组分色谱峰分离度大于1.5；该色谱条件下的对照品与样品色谱图见图1。

2.1.2对照品溶液的配制

精密称取大车前苷对照品12.51 mg，置50 ml棕色容量瓶中，加60%甲醇溶解至刻度，配成浓度为250.2 μg/ml的对照品溶液。

2.1.3供试品溶液的制备

称取车前草饮片10 g，置圆底烧瓶中，加入10倍量70%乙醇，在恒温水浴槽中加热回流提取3次，每次2 h，趁热过滤，合并提取液，并定容到一定体积，作为供试品溶液。

2.1.4线性关系考察

分别量取适量对照品储备液，加60%甲醇稀释成浓度分别为12.51、25.02、50.04、75.06、100.08、125.10 μg/ml的对照品溶液，摇匀，按“2.1.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。以浓度为横坐标(X，μg/ml)，峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归，得回归方程Y=15 543X+52 895(r=0.999 6)，结果表明，大车前苷在12.51～125.10 μg/ml浓度范围内，有良好的线性关系。

2.1.5精密度试验

取浓度为75.06 μg/ml的大车前苷对照品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，测定峰面积，计算得大车前苷平均峰面积的RSD为0.35%，表明该仪器精密度良好。

2.1.6重复性试验

取同一批车前草，平行制备6份供试品溶液，进样，测定峰面积，计算大车前苷含量，平均值为12.26 mg/g，RSD为2.56%，表明该方法的重复性良好。

2.1.7稳定性试验

取同一批车前草饮片，制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h进样测定，计算其峰面积的RSD为0.86%，表明该样品溶液在24 h内稳定。

2.1.8加样回收率试验

精密称取已知大车前苷含量的样品6份，按含量的1∶1加入对照品，按照上述供试品溶液的制备方法制备，测定，计算回收率，结果见表1。

表1 大车前苷的加样回收率试验结果(n=6)

结果表明，平均回收率为98.57%，RSD为1.45%，表明该方法可靠性良好。

2.1.9样品的测定及浸膏得率计算

取适量车前草粉末，精密称定，制备供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20 μl，按“2.1.1” 项下色谱条件测定，采用外标一点法计算样品中大车前苷的含量。同时，精密吸取样品溶液30 ml于恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，放入烘箱中烘干至恒重，计算浸膏得率。

2.2 提取工艺考察

2.2.1提取次数的确定

称取车前草饮片10 g，至圆底烧瓶中，加10倍量70%乙醇，在恒温水浴槽中加热回流，提取4次，每次2 h，考察提取次数对大车前苷含量的影响，结果见表2。

表2 提取次数对车前草中大车前苷含量的影响

由表2可知，4次提取后，大车前苷基本提取完全，第3次提取得到的大车前苷已经很低，以提取4次得到的所有大车前苷的量作为大车前苷的总含量时，提取2次的大车前苷提取量为：10.95 mg/g，提取率达87.5%。从工业化生产成本考虑，提取2次更为经济，因此选择提取2次即可。

2.2.2正交试验设计和结果

采用L9(34)重复正交试验设计，以大车前苷转移率和浸膏得率为评价指标，考察乙醇浓度(A)、乙醇用量(B)、提取时间(C)3种因素对提取率的影响，每种因素按照3个水平设计试验方案，因素水平详见表3。

表3 L9(34)因素水平表

按正交表安排试验，称取中药车前草饮片10 g，将称好的药材置于圆底烧瓶中，加溶剂，在恒温水浴槽里加热回流提取，趁热过滤提取液，并定容到一定体积，得各样品溶液，取样，按照“2.1”项所述试验方法测定大车前苷转移率和浸膏得率，并对试验结果进行分析，结果见表4～5。

表4 正交试验方案和结果

表5 大车前苷转移率、浸膏得率方差分析表

F0.05(2,2)=19.00

由上述直观分析和方差分析结果可知，乙醇浓度、用量和提取时间这3种因素对车前草乙醇提取物的得率以及大车前苷转移率均有影响，其中乙醇浓度和乙醇用量的影响较为显著。从节约成本及有效成分转移率最大化原则考虑，选择60%乙醇(A2)、10倍量药材量(B3)、每次提取1 h(C1)为最佳提取条件。

2.2.3最佳工艺验证

取车前草药材，用10倍药材量的60%乙醇提取2次，每次1 h，3次重复实验结果表明，大车前苷转移率分别为84.77%、85.21%、86.33%，浸膏得率分别为19.88%、21.71%、20.56%。

3 讨论

3.1 HPLC条件的选择

在液相色谱条件优化实验中，比较了甲醇-水系统和乙腈-水系统的分离效果，结果发现乙腈-水系统的分离效果更优。由于大车前苷为弱酸性化合物，在水相中加入一定量酸后，大大改善了色谱峰的拖尾。与乙腈-0.5%磷酸水溶液相比，乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相时，色谱峰的对称性更好，拖尾因子α=1.030。在流动相比例的调整中，乙腈-0.1%甲酸水溶液从17∶83调整到16∶84时，样品中大车前苷的分离度得到极大改善。

3.2 提取方法的选择

在预实验中，以提取液中大车前苷的含量和提取物的得率作为考察指标，考察了冷浸法、热回流法、超声提取法的提取效果，结果发现热回流法所提取的指标性成分含量较高。在提取溶剂的选择上，由于苯乙醇苷类极性较大，一般选取水、乙醇、甲醇等溶剂提取，考虑到车前草在水中的提取效率较低，而溶剂甲醇的成本高、毒性大，故选择乙醇作为提取溶剂。