基因芯片技术在慢性乙型肝炎患者中耐药基因检测的应用情况

刘艳枚 杨梦 刘倩 周鹏 周美芳 尹卫国 黄振勇 禤淑霞 李介华

作者单位：511500 清远市人民医院

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)是一种双链DNA病毒, 引起以肝脏病变为主的乙型肝炎, 随着疫苗大力推广,世界范围内HBV感染增长速度明显减慢, 但仍为我国最流行、危害最严重的一种传染病［1］。抗病毒治疗是控制和预防慢性进展的唯一选择, 4 类核苷和核苷酸类药物(nucleoside and nucleotide analogs, NAs)是目前临床治疗慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者的主要药物, 但常发生HBV对NAs的耐药, 导致治疗失败和疾病进展［2］。本院引进一项用于HBV耐药基因检测项目, 采用基因芯片法检测HBV常见8个耐药位点, 本研究为更好的评价该项技术的灵敏度和特异性, 选用临床常用Nas药物LAM、ADV的3个常见耐药位点rt204、rt181、rt236进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料 选取2015年1月～2016年8月来本院门急诊就治的 210例CHB 患者, 入选条件：①符合《病毒性肝炎防治方案》中CHB的诊断标准；②使用LAM或(和)ADV治疗＞1年；③血清中存在乙肝e抗原(HBeAg)和乙肝病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA), 且通过实验室确证患者血清样本中HBV-DNA载量＞1.0×103 IU/ml, 均知情同意本研究, 经过医院伦理委员会批准, 分离血清样本放置-20℃下保存。

1.2 方法

1.2.1 试剂及仪器 HBV耐药突变基因检测试剂盒由亚能生物技术(深圳)有限公司提供, 主要检测仪器有Life Express基因扩增仪、eppendorf高速离心机、FYY-3型分子杂交仪、BioBase生物安全柜, 一代测序筛选部分外送凯普生物技术有限公司完成。

1.2.2 基因扩增 取 200 μl 血清, 经过裂解液将 HBV-DNA释放, 无水乙醇和W液洗涤, TE液溶解, 取5 μl基因产物进行聚合酶链式反应(PCR)反应, 反应条件为：50℃、95℃10 min ；94℃ 60 s, 68℃ 30 s , 30 循环 ；94℃ 30 s、54℃ 30 s、72℃ 30 s, 48 循环 ；72℃ 5 min, 扩增完成。

1.2.3 基因芯片杂交 将扩增的DNA产物进行变性, 放入芯片上进行杂交, 芯片上包含rt204、rt181、rt 236位点的所有的野性型和突变型, 待芯片杂交完成后在光学分析仪上进行扫描。

1.3 观察指标 ①测序法检测基因突变结果；②基因芯片检测的灵敏度、特异性。灵敏度=真阳性/(真阳性+假阴性),特异性=真阴性/(真阴性+假阳性),

2 结果

2.1 测序法检测基因突变结果 210例CHB患者中, 测序法检测出rt204位点突变者42例、检出率为20.00%, rt181位点突变者24例、检出率为11.43%, rt236位点突变者18例、检出率为8.57%, 未发生突变者为126例。虽然CHB患者主要以LAM耐药基因rt204位点突变为主, 但是 ADV耐药基因rt181、rt236也发生了一定程度上的突变(见表1, 图1)。

2.2 基因芯片检测的灵敏度、特异性 210例CHB患者中,基因芯片检测发现204位点突变者44例, 181位点突变者25例, 236位点突变者21例。基因芯片技术检测HBV基因rt204位点突变的灵敏度为95.24%, 特异性为97.62%；rt181位点突变的灵敏度为91.67%, 特异性为98.39%；rt236位点突变的灵敏度为94.44%, 特异性为97.92%, 均达到高的灵敏度和特异性(见表1, 图1)。

表1 两种技术检测HBV基因突变情况(n, n=210)

图1 测序法检测HBV耐药基因图注：该患者体内HBV基因的rt204M位点突变为rt204I

3 讨论

临床治疗CHB主要采用核苷和核苷酸类药物, 但在治疗过程中很容易发生基因突变引起耐药, 常用Nas药物LAM, 在选择性压力下最常见HBV-DNA 聚合酶的酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(YMDD)变异, 即由YMDD变异为YIDD(rtM204I)或YVDD(rtM204V), 使LAM与HBVDNA 聚合酶的亲合力下降或消失, 变异的HBV逐渐成为对LAM耐药的优势株。对于CHB患者, 耐药是一个极为严重的打击, 不仅增加发生肝功能失代偿和肝细胞癌(HCC)的风险而加速疾病进展, 同时还会加大后续治疗的难度, 增加长期治疗的医疗成本［3,4］。

目前在临床上对于耐药基因的检测尚无统一的规范［5,6］,PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)分析、肽核酸介导的PCR钳制连接酶检测反应、微阵列、质谱分析等技术, 高度可靠但耗时长, 需要熟练的技术人员来执行［5-8］。直接HBV-DNA的测序被认为是检测LAM、ADV耐药HBV突变基因的金标准, 但它是一种耗时且费力的方法, 仅在突变病毒占病毒总数的至少25%时检测突变病毒［9,10］。基因芯片是一项基于PCR技术和反向斑点印迹(RDB)法并同时检测多个突变位点的技术, 在rt204、rt181、rt236位点突变的灵敏度达到90%以上, 特异性甚至达到98%以上, 但有趣的是基因芯片法在rt204、rt181、rt236三个位点阳性检出率均比测序法高, 可能的原因有其检测线低, 可检测出5%以上突变病毒, 灵敏度可能比直接测序法高。

综上所述, 基因芯片技术作为一种操作简单、高敏感和特异性分子生物学检测技术, 有望推广成为HBV耐药基因检测的一种便捷、精准的检测方法, 为广大CHB患者提供及时、有效的耐药监测。