亚溶解型C5b- 9刺激GMC诱导KLF4与PCAF结合及结合部位的鉴定

虞天一，何风霞，赵晨卉，余明皓，赵聃，刘玉，宫雅娟，夏露，邱文，张婧，王迎伟

(1.东南大学附属中大医院 妇产科，江苏 南京 210009； 2.南京医科大学附属第二医院病理科，江苏 南京 210003； 3.南京医科大学 免疫学系，江苏 南京 211166；4.南京医科大学第一附属医院 肿瘤科，江苏 南京 210029)

人类系膜增生性肾小球肾炎(mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN)是以肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell，GMC)病变为主的肾炎[1]，至今发病机制不明。大鼠Thy- 1肾炎(Thy- 1N)是研究MsPGN的模型,其病变有亚溶解型C5b- 9的依赖性[2- 3]。亚溶解型C5b- 9刺激GMC能上调一些转录因子和转录辅激活因子，调控基因表达，导致细胞凋亡[3- 4]或促炎因子合成[5]，但其调控作用和机制尚未阐明。

Kruppel样因子4(kruppel- like factor 4,KLF4)是一个Kruppel样家族的转录因子，对细胞的发育和炎症有调控效应[6]。P300/CBP相关因子(P300/CBP- assodated factor,PCAF)是具有乙酰转移酶活性的转录辅激活因子[7]，既能与转录因子作用，又可对蛋白进行乙酰化修饰[8]，参与调控细胞周期和炎症。

本实验前期发现，在Thy- 1N大鼠肾组织中或体外，用亚溶解型C5b- 9刺激大鼠GMC后KLF4和PCAF表达上调，且两者的表达时相较接近。鉴于亚溶解型C5b- 9是Thy- 1N大鼠GMC病变的启动原，故本研究拟探讨亚溶解型C5b- 9刺激GMC后KLF4与PCAF的结合情况及具体的结合部位，以期为今后解析MsPGN的致病机制提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

大鼠GMC细胞系(HBZY- 1)由中国典型培养物保藏中心提供。多克隆兔抗Thy- 1抗体(Thy- 1 Ab)由本室制备。补体来自20名正常人血清(NS)，补体热灭活血清(heat- inactive serum，HIS)是指经56 ℃ 30 min灭活后的NS。人C6缺陷血清(human C6 deficient serum, C6DS)购于美国Complement Technology公司。重组人C6来自北京义翘神州生物技术有限公司。

免疫沉淀(immunoprecipitation，IP)细胞裂解液和兔IgG、羊IgG均购自上海碧云天生物技术研究所。小鼠β- actin单克隆抗体(BM0627)由武汉博士德生物工程有限公司提供。羊KLF4多克隆抗体(sc- 1905)购于美国Santa Cruz公司。兔PCAF单克隆抗体(ab- 176316)购于美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 GMC的培养和亚溶解型C5b- 9的确定 将GMC细胞系加入完全MEM液中培养。用棋盘滴定法即以不同浓度的Thy- 1 Ab致敏GMC，然后加不同浓度正常人血清孵育。之后，用乳酸脱氢酶(LDH)法测定GMC溶解百分率，GMC溶解坏死率小于5%视为亚溶解剂量[3- 5]。本实验确定以5% Thy- 1 Ab与4% NS作为形成亚溶解型C5b- 9的最佳剂量。

1.2.2 亚溶解型C5b- 9刺激GMC时间点和分组处理 以亚溶解型C5b- 9分别刺激GMC 1、2、3、4、5、6、7和8 h；分成亚溶解型C5b- 9(5% Thy- 1 Ab+4% NS)、Thy- 1 Ab(5% Thy- 1 Ab)、Thy- 1 Ab(5% Thy- 1 Ab)+HIS(4% HIS)、Thy- 1 Ab(5% Thy- 1 Ab)+C6DS(4% C6DS)、Thy- 1 Ab(5% Thy- 1 Ab)+C6DS(4% C6DS)+C6(2 mg·L-1)和MEM培养液6组[4]。

1.2.3 质粒的构建、鉴定与转染 构建pIRES2- KLF4和pIRES2- PCAF过表达质粒以及pIRES2- HIS- KLF4和pIRES2- HIS- PCAF结构域质粒，即(1)KLF4- S1(1～155 aa)、KLF4- S2(156～383 aa)、KLF4- S3(384～399 aa)和KLF4- S4(400～482 aa)；(2)PCAF- S1(1～386 aa)、PCAF- S2(387～443 aa)、PCAF- S3(444～567 aa)和PCAF- S4(568～674 aa)。将上述质粒用NeonTM细胞电转染系统转入GMC中[3- 5]。

1.2.4 IP和IB实验 不同处理的细胞加裂解液处理，具体的IP和IB实验方法与步骤参见文献[3- 5]。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 亚溶解型C5b- 9刺激GMC后KLF4与PCAF结合情况

用亚溶解型C5b- 9刺激GMC不同时间，结果显示，在刺激2 h时KLF4与PCAF的结合明显升高，3 h时达到峰值，见图1。表明亚溶解型C5b- 9刺激GMC后使KLF4与PCAF的表达升高并相互结合。

A.电泳条带；B.半定量分析，与MEM培养液组比较，aP<0.05

图1亚溶解型C5b-9刺激GMC不同时间KLF4与PCAF结合情况

2.2 不同处理组的GMC中KLF4与PCAF相互结合水平的比较

将GMC按前述6组处理，用KLF4抗体IP后用PCAF抗体进行IB检测。检测结果发现，亚溶解型C5b- 9组和Thy- 1Ab+C6DS+C6组与KLF4结合的PCAF水平高于其他组，见图2。提示亚溶解型C5b- 9刺激GMC 3 h确能提高PCAF与KLF4结合的水平。

2.3 KLF4、PCAF过表达质粒及KLF4、PCAF结构域质粒的构建与鉴定

IB检测证实，转染pIRES2- KLF4或pIRES2- PCAF的GMC中能表达KLF4或PCAF蛋白。将KLF4分成4个结构域，即KLF4- S1(1～155个氨基酸的转录激活结构域)、KLF4- S2(156～383个氨基酸的转录抑制结构域)、KLF4- S3(384～399个氨基酸的核定位信号

1为sublytic C5b- 9组，2为Thy- 1 Ab组，3为Thy- 1 Ab+HIS组，4为Thy- 1 Ab+C6DS组，5为Thy- 1 Ab+C6DS+C6组，6为MEM组，7为IgG对照组

A.电泳条带;B.半定量分析,与MEM组比较，aP<0.01

图2不同处理组GMC中KLF4与PCAF结合的比较

NLS)、KLF4- S4(400～482个氨基酸的锌指DNA结合区域)，并在5′端插入HIS标签，构建了pIRES2- HIS- KLF4的4个结构域表达质粒。进而将PCAF蛋白分成4个结构域：分别为1～386个氨基酸的转录结合结构域、387～443个氨基酸的乙酰基转移酶活性域、444～567个氨基酸的酵母转录辅激活子同源区、568～674个氨基酸的Bromo结构域，并命名为PCAF- S1、PCAF- S2、PCAF- S3和PCAF- S4。在5′端插入HIS标签，构建了pIRES2- HIS- PCAF的4个结构域表达质粒。以上所有质粒测序结果正确，表明构建成功。

2.4 KLF4与PCAF结合部位的鉴定

将带HIS的PCAF- S1、PCAF- S2、PCAF- S3和PCAF- S4分别与pIRES2- KLF4共转染GMC 48 h，行IP和IB检测发现，共转染PCAF- S1和pIRES2- KLF4的KLF4表达量增高(图3)。提示KLF4蛋白结合于PCAF的S1结构域(即转录结合结构域)。

将带HIS的KLF4- S1、KLF4- S2、KLF4- S3和KLF4- S4分别与pIRES2- PCAF共转染GMC后48 h，行IP和IB检测证实，KLF4- S1与pIRES2- PCAF转染组的KLF4表达量升高(图4)。提示PCAF结合在KLF4的S1结构域(即转录激活结构域)。

3 讨 论

KLF4是一种能参与转录调控的转录因子，其结构包括转录激活结构域、转录抑制结构域、核定位信号和DNA结合结构域。已有研究表明，KLF4能通过结合HMGB1调控炎症因子的表达[6]。PCAF属于一种转录辅激活因子，其结构含有转录结合结构域或PCAF同源结构域、乙酰基转移酶活性域、酵母转录辅激活子同源区和布罗莫结构域。已有研究[9]发现，PCAF可与KLFs家族成员相互作用，并能乙酰化修饰KLF4，参与肺上皮的炎症。

1为PCAF- S1+pIRES2- KLF4组，2为PCAF- S2+pIRES2- KLF4组，3为PCAF- S3+pIRES2- KLF4组，4为PCAF- S4+pIRES2- KLF4组

A.电泳条带；B.半定量统计图;与PCAF- S2+pIRES2- KLF4组、PCAF- S3+pIRES2- KLF4组、PCAF- S4+pIRES2- KLF4组比较，aP<0.01

图3KLF4在PCAF上的结合部位鉴定

1为KLF4- S1+pIRES2- PCAF组，2为KLF4- S2+pIRES2- PCAF组，3为KLF4- S3+pIRES2- PCAF组，4为KLF4- S4+pIRES2- PCAF组

A.电泳条带；B.半定量统计图,与KLF4- S2+pIRES2- PCAF、KLF4- S3+pIRES2- PCAF组、KLF4- S4+pIRES2- PCAF组

图4PCAF在KLF4上的结合部位鉴定

本实验前期研究证实，在Thy- 1N大鼠的肾组织和GMC用亚溶解型C5b- 9处理后，KLF4和PCAF的表达明显上调，且时相基本一致。因此设想，亚溶解型C5b- 9刺激GMC或许可诱导KLF4和PCAF相互结合，进而调控靶基因的转录。

为了确证这一推测，本实验先用IP和IB鉴定了由亚溶解型C5b- 9刺激诱导的KLF4和PCAF的结合变化。结果显示，在亚溶解型C5b- 9刺激GMC 2 h时KLF4和PCAF相互结合已明显升高，3 h时达到峰值。进一步分组实验表明，亚溶解型C5b- 9和Thy- 1 Ab+C6DS+C6组,KLF4和PCAF相互结合量也显著上调。表明受亚溶解型C5b- 9刺激的GMC能诱导KLF4和PCAF结合增加。

本实验又构建了带HIS标签的结构域表达质粒，分别与KLF4或PCAF的过表达质粒共转染GMC。用标签抗体行IP和IB检测证实，KLF4结合于PCAF的转录结合结构域，而PCAF则结合在KLF4的转录激活结构域。提示在大鼠Thy- 1N时，在GMC膜上的亚溶解型C5b- 9可刺激GMC，诱导转录因子KLF4与转录辅激活因子PCAF相互结合形成复合物，而此复合物可能对其下游靶基因的转录发挥一定的调控作用。