高通量转录组测序在人类配子发生及植入前胚胎发育研究中的应用进展

罗斌，吕自力，单旭东，赵情梅，梁鑫

(成都中医药大学附属生殖妇幼医院，成都 610041)

高通量测序(next generation sequencing，NGS)是现代分子生物手段运用比较普遍的技术，其中高通量转录组技术(RNA sequencing，RNA-Seq)更是为临床研究提供了便捷的手段。转录组(transcriptome)是组织或细胞在特定环境或生理状态下转录表达的所有RNA的转录本，即包括编码/非编码蛋白的mRNA，以此来判断这段特殊基因组区域的转录水平，可以从整体上反映出细胞中基因的表达情况及其调控规律。因此，RNA-Seq技术为研究基因表达及调控提供了重要的手段和方法，得到广泛使用。

配子细胞及早期胚胎的RNA含量低，难以达到转录组测序建库所需要的RNA最小起始量要求。早期构建的体外培养的人卵母细胞、4-细胞、8-细胞和32-细胞期的文库[1]，为今后的研究奠定了基础。随着NGS、RNA-Seq及Smart-seq2等微量测序技术的建立与发展，以及单细胞基因组测序技术的运用，使RNA-Seq技术的运用变得更加成熟，摆脱了转录组建库RNA含量低的束缚。许多研究小组已经利用SAGE技术、生物芯片、原位杂交和基因敲除等方法对人类卵母细胞、植入前胚胎以及单个器官的发育进行了基因表达及转录本的研究。有研究者利用基因敲除等方法经过数年的研究，发现与男性不育症密切相关的基因近200个[2]，这些基因的突变、缺失或表达异常，可能是男性不育症发生的重要原因。目前已成功利用RNA-Seq技术在人植入前胚胎发育[3]及其他物种[4]的早期胚胎发育调控机制方面开展过一些初步研究，而人类配子发生方面的转录组研究较少。高通量RNA-Seq技术具有显著的优势，可以在较短时间内大规模研究组织或细胞里多个基因的差异表达，筛选相关基因，也可以研究细胞通路和调控网络，为解析不孕不育调控机制提供理论基础。

一、RNA-Seq对配子发生的研究

1.卵母细胞研究：RNA-Seq技术已经运用在人类着床前胚胎发育过程中基因表达调控机理等方面的研究，但对卵母细胞的测序研究较少[5]。有学者对人类卵母细胞极体和原核进行单细胞全基因组测序分析，并确定了其卵母细胞的杂交图谱，推断出疾病相关等位基因中的非整倍体和单核苷酸多态性(SNP)，获得了减数分裂重组信息[6]。对比基因组测序，RNA-Seq技术具有明显的优势，可以比较正常和异常发育卵母细胞之间的分子水平差异：定量揭示基因调控以及表观遗传变异引起的基因表达缺陷，也可以分析SNP及调节通路，而这些基因调控超出了DNA测序的检测范围。有学者利用单细胞RNA-Seq技术对体外和体内成熟的人卵母细胞的转录组测序分析，发现调节人类卵母细胞成熟的关键基因与细胞通路，从RNA测序数据中筛选成熟相关的差异表达基因2 230个[7]，如ACAT1、HADHA和ALDH2等基因；并发现81条细胞通路，其中，27%与代谢有关，19%与信号通路有关。

2.精子发生过程研究：精子发生障碍主要是由基因突变和染色体异常的遗传缺陷引起的。近年来，基因组范围的微阵列和RNA测序研究丰富的生精细胞群体或模型动物的睾丸样本，为人类精子发生的分子控制提供了基础。Montjean等[8]用基因表达探针法对比不育男性和正常男性的精液差异表达基因，发现大约15%的调控基因在精子发生中起作用。RNA-Seq技术可以筛选异常基因，为男性不育提供了新的线索。Djureinovic等[9]利用RNA-Seq技术对人睾丸组织进行了深入测序，并与其他器官组织进行了比较，根据表达模式将人类基因进行分类，结果表明睾丸是迄今为止组织特异性最强的基因。同样，Zhu等[10]利用RNA-Seq技术对人类睾丸组织进行转录组测序，也发现睾丸组织的特异表达基因最多。

通过运用RNA-Seq技术与1 000多份高丰度精子转录本比对中，鉴定出900多份参与了精子发生、转录调控、精子运动和能力、受精和胚胎发生等生物学过程的基因，将这些基因用于比较受精卵和雄性精子的mRNA产物，发现特发性不孕症患者生殖细胞转录谱与生育个体之间的不同[11]。另外，有研究通过对卡尔曼综合征(KS)患者单个精子细胞测序与正常精子基因组序列比较，发现有数百个差异表达基因[12]，这为KS患者临床治疗指明了方向。最近Chen等[13]应用精度高的单细胞RNA-Seq方法，建立小鼠精子发生过程的转录组图谱，揭示了精子发生过程中基因表达调控的动态变化，这为人类精子转录组研究奠定了基础。

RNA-Seq在筛选精子发生相关基因应用上有巨大潜能：通过一些生物技术手段鉴定了大量与精子发生相关的基因。与生精功能相关的基因有很多，如ODF1、ODF2和CLOCK等[14-16]。与生精相关的其他基因及与运动相关的基因也需要进一步的发掘研究。利用免疫组化等方法通过对PIWI蛋白相互作用RNA(PIWI/piRNA)通路的研究，发现该通路与人类无精子症相关，即该通路可能在精子发育的过程中有着重要的保护作用[17]。另外，有研究人员利用单细胞高通量全基因组测序技术对单个精子细胞进行研究，鉴定出20多个在二倍体细胞基因组中并不存在的单核苷酸突变[18]

因此，RNA-Seq技术为我们提供了很好的筛选基因的工具，对筛选精子发生和卵母细胞成熟相关基因有巨大的潜能。采用高通量RNA-Seq技术能为我们发掘病理相关基因，更高效的研究细胞信号通路及表观遗传，为进一步研究打下基础。

二、RNA-Seq对植入前胚胎发育的研究

1.早期胚胎的转录组研究：RNA-Seq技术已经运用于人类着床前胚胎发育过程中基因表达调控机理等方面的研究。Dobson等[19]通过分析人类着床前胚胎的转录组，发现近2 000种mRNA在Day3的表达有明显变化，而只有小部分基因在Day1～2上调或下调。Vassena等[20]通过RNA-seq分析人类单个胚胎，成功建立人类胚胎资源数据库，为综合分析胚胎发育过程调控提供了参考。Yan等[3]利用单细胞RNA-seq技术测定人类着床前胚胎和胚胎干细胞的基因表达，检测到20 000多个表达的基因，包括8 000多个长非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)，并成功绘制出完整的人类着床前单胚胎转录组精细图谱，为今后胚胎发育的研究奠定了基础。单细胞RNA-Seq技术将逐渐应用到临床实践中，方便对人类早期胚胎细胞基因程序化解析。

2.胚胎表观遗传研究：高通量RNA-Seq改进方法也得到了广泛运用。Guo等[21]利用微量细胞DNA甲基化高通量测序技术，对人类早期胚胎发育过程中DNA甲基化重编程的系统深入解读。另外，利用高精度的单细胞多组学测序技术，成功解析了人类着床前胚胎发育过程中DNA甲基化组和染色质状态组的重编程过程，以及染色质状态与DNA甲基化之间的相互关系等关键生物学特征[22]。随后该研究团队采用单细胞DNA甲基化高通量测序技术，绘制出人类着床前胚胎发育的DNA甲基化图谱，进一步揭示了胚胎的去甲基化重编程以及父源/母源基因组差异甲基化等特征[23]。

Wu等[24]采用RNA-Seq技术，发现人类早期胚胎发育过程中基因组转录激活对于开放染色质区域重编程的关联性，为深入理解人类胚胎早期发育表观遗传调控提供了理论基础。同年，Li等[25]研究证明了人类和小鼠胚胎中父源/母源基因组的染色质开放程度差异：人类胚胎不同于小鼠胚胎的物种特异性的关键表观遗传学特征。这为研究非整倍体等发育异常的胚胎，以及反复流产等临床医学问题提供了新思路和新研究手段。

3.植入前胚胎检测：自然流产和不孕不育比例逐年增加，利用NGS技术可精确排查染色体变异的原因，提高治疗效率。体外受精患者的妊娠失败绝大部分都是由于胚胎的非整倍性造成的，导致胚胎停止发育而发生流产的重要原因之一是胚胎的染色体异常，因染色体数目异常引发的自然流产率高达23%以上。Carvalho等[26]比对了全基因组拷贝数变异(copy number variants，CNVs)数据库，发现其中与胚胎停育及早期流产相关的致病性CNVs约29个。另外，RNA-Seq可用于复发性流产绒毛组织的染色体拷贝数变异分析，检测出亚显微结构的染色体异常[27]。RNA-Seq方法检测率高、分辨率高，对自然流产患者的遗传咨询及生育指导具有重要意义。

NGS技术在辅助生殖治疗中最经典的应用是胚胎植入前遗传学诊断(PGD)和植入前遗传学筛查(PGS)。基于NGS技术的PGS/PGD将大大提高移植率、妊娠率，降低流产率。PGS/PGD结合RNA-Seq技术可在较短的时间内给予病因学诊断，弥补了传统荧光原位杂交(FISH)技术、染色体核型分析和微阵列比较基因组杂交(CGH)等技术的不足。因此，RNA-Seq技术在胚胎植入前遗传学诊断中有极大的优势，其应用效果和价值较高，可以解决因囊胚形成率低而无可活检的胚胎用于PGD的难题。

4.早期胚胎发育相关基因研究：早期胚胎发育过程中发现了大量相互调控的相关基因，RNA-Seq技术可以大规模筛选这些基因。早期胚胎发育是遗传信息依据一定的时间、空间和次序表达的结果，伴有大量基因的激活，如胚胎细胞转录因子NANOG、OCT4和CLDN4等基因。NANOG能调控合子基因组的激活，缺乏NANOG的胚胎合子基因组激活率低、发育受阻，而CLDN4抑制因子也会导致胚胎不能形成正常的囊胚腔[28-29]。早期胚胎的发育属母型调控，母源mRNA在胚胎发育早期起着重要生理作用[30]。随着发育的进行，发育从母型调控向胚胎型调控过渡(maternalto-embryonic transition，MET)，MET在不同的物种发生的时期并不相同，如小鼠MET发生在2-细胞期，人MET在4-到8-细胞期。早期胚胎发育遗传程序中仍有大量基因的表达差异尚未发现，因此，RNA-Seq技术在筛选更多胚胎发育调控相关基因以及研究MET调控上有巨大潜力。

5.胚胎基因其他研究：SNP在生物体胚胎发育的不同阶段中普遍存在。转录组测序可以分析SNP、微小RNA(microRNAs，miRNAs)及长片段非编码RNA(lncRNAs)。miRNAs/lncRNAs表达及多态性与早期胚胎发育和着床的关系逐渐引起关注，但采用转录组技术对其研究较少。miRNAs在多种生物学过程中具有调控作用，包括细胞增殖、分化和凋亡以及胚胎发育和着床[31]。研究发现miRNAs编码区SNP可能会干扰成熟miRNAs的表达，引起胚胎发育异常，增加复发性流产的风险[32]。另外，研究者利用RNA-Seq技术发现在早期胚胎发育的过程中lncRNAs发挥了重要的相关调控功能[33]。

RNA-Seq可以对胚胎发育细胞通路进行广泛的研究。研究发现在早期胚胎发育过程中剪接体通路和内吞作用通路与胚胎母源RNA降解和基因组的启动有关[34]，细胞因子及其受体相互作用通路在早期胚胎的发育和植入过程中发挥重要作用。胚胎植入反复失败的妇女子宫内膜中有许多mRNA表达异常，其中表达下调的多数mRNA都涉及细胞因子及其受体相互作用通路[35]。

三、小结与展望

随着高通量测序技术快速的发展，更多的研究人员将其作为工具来挖掘人类不孕不育基因组资源，其高通量的优势极大地促进人类不孕不育的研究。此外，与外显子或基因组的高通量测序相比，转录组测序具有明显的优势，可以定量揭示基因调控以及表观遗传变异引起的基因表达缺陷，也可以分析SNP及调节通路，而这些基因调控超出了DNA测序的检测范围。转录组分析既可探究无精子症患者差异表达基因，挖掘更多与精子成熟、运动和贮存密切相关的功能基因，也可以研究辅助生殖中卵母细胞成熟、受精卵发育和着床等相关的表达基因及其表观遗传。单细胞转录组测序技术的运用成熟更是为辅助生殖研究提供了便捷。

怎样更好地将高通量转录组测序技术应用在人类不孕不育研究中？如何很好地发挥出转录组测序的优势？如何发掘出特殊的基因并预测其功能？这一系列问题都将是在人类不孕不育转录组研究中所要重点考虑的。