环境暴露对精子小非编码RNA介导跨代遗传影响的研究进展

徐偲越，郭艺红

(郑州大学第一附属医院生殖与遗传专科医院，郑州 450052)

表观遗传是指在不改变DNA序列的情况下基因表达的改变，这种改变可由外部环境所引起。目前，许多证据表明表观遗传信息可通过配子在子代中传递，这种形式被称为跨代遗传[1-3]。这种快速直接的遗传方式具有一定的进化优势，能够使后代更好地适应环境。以往大量研究发现母体的健康状况及生活方式可通过表观遗传机制影响后代，如妊娠前肥胖、宫内不良环境暴露等[4-6]。近年来，越来越多的证据表明父代的环境暴露及生活习惯也可通过精子跨代遗传影响子代的表型[7-8]。由精子介导的跨代遗传主要涉及DNA甲基化、组蛋白乙酰化及小非编码RNA等。非编码RNA(non-coding RNAs)是指DNA转录后不作为翻译模板的一类功能性的RNA分子，可参与调控转录、RNA的加工及翻译等[9-10]。其中长度小于200 nucleotide(nt)的非编码RNA称为小非编码RNAs(small non-coding RNAs，sncRNAs)[11]。近年来，研究较多的主要有miRNA、piRNA、rbRNA、tRNA，这些sncRNAs被认为在跨代遗传中发挥重要作用[12]。本文将对精子中的小非编码RNA跨代遗传机制进行综述，重点阐述环境影响的正反两方面在父代跨代遗传中的作用。

一、不良环境的影响

(一)父代压力及应激对后代表型的影响

压力会影响性欲，降低精子数量和质量，并长期危害睾丸细胞[13-14]。近年来大量研究表明压力诱导的父代个体的行为适应性可通过精子表观遗传传递给后代。

1.压力引起的行为变化：多种神经/精神疾病与下丘脑-垂体-性腺轴(HPA轴)相关，如精神分裂症、抑郁症等[15]。相关研究表明父代遭受应激后可以通过诱导生殖细胞的表观遗传重编程并使后代HPA轴失调，随后观察发现精子中的miRNA含量发生变化[16]。研究人员进一步将这些被改变的miRNA注入到单细胞的受精卵中，来自这些受精卵的雌性和雄性小鼠也表现为HPA轴失调[17]。

为了研究父代压力如何通过HPA轴失常对父代精子含量产生影响以及由此介导的行为变化，国外一研究小组给交配之前的雄性小鼠(F0代)持续4周服用含有糖皮质激素(CORT)的水来模拟应激状态下父代小鼠的生理变化[18]，在高架十字迷宫(一种测试动物焦虑状态的模型)及明暗箱实验中，尽管CORT并不影响父代雄性小鼠的焦虑行为，但CORT组F1雄性小鼠表现为焦虑样行为，CORT组F1雌性小鼠表现为恐惧消失。有趣的是，父本印记基因Igf2的表达在F1雄性后代参与应激的海马中增加，但在雌性后代中下调。而与对照组相比，CORT组F2雄性和雌性小鼠均表现为焦虑程度降低，并发现只有CORT组F2雄性小鼠减少了在强迫游泳实验(抑郁行为实验)中的活动；与对照组相比，CORT组后代发现差异表达的sncRNAs超过100种，其中数量最多的两大类为miRNA和tRNA。来自CORT组精子中三种miRNA(miR-98、miR-144和miR-190b)水平升高，预计它们会与多种生长因子(包括两种基本生长因Igf2和Bdnf)相互作用。研究表明，压力(通过压力经历)和升高的应激激素水平(通过服用CORT)可以改变精子miRNA的含量，并且这些变化至少影响两代。至于这些性别差异是如何发生的，目前尚无相关明确机制，有人提出性染色体可以通过HPA轴影响性腺激素水平，进而表现为不同的行为特征[19]。

一种将不可预测的母体分离与不可预测的母体应激相结合(model of unpredictable maternal separation combined with unpredictable maternal stress，MSUS)的小鼠模型为我们研究表观遗传提供了很好的思路，这种早期暴露于创伤性压力的模型可形象地转化为人类的童年压力及创伤[20-21]。在MSUS模型中早期应激小鼠(F0)可影响后代行为特征及sncRNAs含量。在高架十字迷宫及明暗箱等行为实验中，F1 MSUS小鼠表现出了类似焦虑的行为特征，这些获得性的性状在F2 MSUS小鼠也被观察到。研究者应用PCR及深度测序分析显示，在F1 MSUS小鼠精液中部分miRNA上调，而部分piRNA下调。除此之外，成年F1 MSUS小鼠的血清及海马的sncRNAs也发生了改变。继续观察发现，尽管F3 MSUS小鼠与F1及F2 MSUS小鼠有相似的行为特征，但sncRNAs在F2 MSUS小鼠的血清及海马中受到影响，在精子中却未发生任何改变，而F3 MSUS小鼠的sncRNAs是正常。值得注意的是，当将这些差异表达的sncRNAs注射到野生型受精的卵母细胞中时，来自这些受精卵的小鼠表现出与F0 MSUS类似的行为变化和分子效应，并且检测到海马中的某些sncRNAs发生显著变化；注射有sncRNAs受精卵的小鼠后代亦有类似抑郁的表现。这些发现都说明了精子miRNAs在跨代遗传中的直接作用，强调了miRNAs在生殖细胞中的重要性及对早期应激的敏感性[20]。

2.压力引起的代谢变化：在压力环境中除了引起后代行为变化之外，亦对代谢产生一定影响。MSUS模型中研究者测定了压力对代谢的影响[20]，在F1 MSUS小鼠中，血清中的胰岛素和葡萄糖水平都显示在正常水平，F2 MSUS小鼠虽然葡萄糖水平尚在正常范围，而胰岛素水平低于正常对照组，且在胰岛素耐受实验和葡萄糖耐受实验中均下降；F2 MSUS小鼠亦表现为一种超代谢，在摄入量较高的情况下，体重仍低于对照组。继续观察发现，来自注射sncRNAs受精卵的小鼠胰岛素和血糖水平降低，体重下降。表明父代压力引起葡萄糖代谢的变化，并通过精子sncRNAs在跨代遗传中发挥作用。有压力的F0雄鼠后代F1雌鼠的糖皮质激素水平明显升高[22]。与F1雌鼠不同的是，F2和F3雌鼠并没有表现出增强的糖皮质激素水平，但继承了父代相关的行为。此外，所有雌性小鼠(从F0到F3)均显示Rcan 1和Rcan 2的mRNA水平升高，这与海马CA1区域的突触可塑性有关。

我国学者亦对父代应激引起子代代谢变化做了相关研究。研究者发现F0雄鼠应激后糖皮质激素水平升高，从而引起控制miRNA-466l-3p表达的精子Sfmbt2基因启动子甲基化程度增加，这种表观遗传修饰导致子代肝脏中的miRNA-466l-3p表达显著下调，从而调节PKPCK蛋白表达增加，引起子代F1小鼠血糖升高、糖异生增加[23]。

(二)父代饮食对后代表型的影响

在哺乳动物中，跨代遗传不仅发生在压力环境中，父代饮食变化亦通过精子跨代遗传导致子代表型发生改变[24-25]。Fullston等[26]为了研究饮食引起的父代肥胖对后代代谢健康及精子分子结构的影响，将F0代C57BL/6J雄鼠喂食高脂肪食物(high fat diet，HFD)或控制饮食(control diet，CD)10周，随后研究者将两代F1及F2都进行CD维持，结果发现HFD组F0雄鼠的肥胖增加21%并且其后代F1和F2都增加了肥胖及胰岛素抵抗的风险，其中F1雌鼠肥胖增加67%，F2雄鼠肥胖增加24%；通过微阵列、PCR等技术分析发现F0雄性肥胖改变了睾丸中的414个微阵列和11个miRNA的表达，同时改变了精子的miRNA含量。而Thais等[27]与上述研究结论并不一致，他们研究发现HFD组的后代中，雌鼠表现为葡萄糖不耐受，并且容易引起HFD诱导的体重增加，而HDF的F0及F1雄鼠其DNA甲基化和sncRNAs表达正常。结果显示这种跨代遗传是通过miRNA let-7c在精子中的的表达改变传递到后代的代谢组织中，从而诱导let-7c靶点的转录组发生移位。在HFD父代小鼠模型中，Chen等[8]发现了精子tRNA衍生的小RNA(tsRNA)表达谱和修饰的变化；将来自HFD雄性的精子tsRNA注射到正常受精卵中，在F1后代中发生代谢紊乱，并且在早期胚胎和F1后代的胰岛中改变了代谢途径的基因表达。

虽然精子sncRNAs如何编码父系信息仍不清楚，但其机制可能涉及RNA修饰。Zhang等[28]发现删除小鼠中的tRNA甲基转移酶—Dnmt2后将会阻止精子sncRNA介导的高脂饮食诱导的代谢紊乱传播给后代。研究显示Dnmt2缺失阻止了高脂饮食诱导的精子30-40 nt RNA部分RNA提取物(m5C、m2G)的升高；此外，Dnmt2缺失改变了精子小RNA表达谱，包括tRNA衍生的小RNAs和rRNA衍生的小RNAs的水平，这可能在构建父系表观遗传记忆所需的精子RNA编码中是必需的。Sharma等[29]调查了父代饮食影响子代代谢的机制：小鼠的低蛋白饮食将影响成熟精子中的小RNA(sRNA)水平，导致let-7水平降低和～28-34 nt tRNA片段(tRFs)数量增加(主要来自于tRNA的5’端)；其机制为睾丸中的精子tsRNA片段较少，当进入附睾后，附睾体(在附睾运输过程中与精子融合的囊泡)携带成熟精子相匹配的tsRNA载体，将tsRNA传递给成熟精子，使精子中的tsRNA片段增加。Chen等[8]将附睾体中的tsRNA 注入到正常的胚胎中，结果显示：tsRNA 引起了胚泡多种基因表达量的改变并且大部分基因在机体的代谢调控通路中表达；进一步研究发现tRNA及tsRNA的修饰均会影响tsRNA的功能，从而影响遗传相关的代谢疾病。

(三)父代饮酒对后代表型的影响

近期研究表明，不仅孕期饮酒增加后代代谢风险，父代长期饮酒也可能对后代的健康和发育产生重要影响。Rompala等[30]应用高通量测序证实了乙醇对精子sncRNAs的影响：他们发现慢性间歇性乙醇暴露改变了精子中三种主要的小RNA(tRNA衍生的小RNA、线粒体小RNA和微RNA的几种sncRNAs)；另外利用PCR验证了sncRNAs因慢性乙醇的暴露而改变；同时发现慢性乙醇暴露亦影响sncRNAs的转录后修饰，增加线粒体tRNA中两种核苷修饰。

二、良好环境的影响

与压力相反，积极的环境因素可以改善人类的压力反应和认知能力。积极的环境包含增强体育锻炼、多样环境或其他形式的增强运动，如感觉、认知等刺激。多样环境是一种将体育锻炼与认知训练相结合的方式。

(一)父系体育锻炼对后代表型的影响

1.运动对行为影响：国外研究小组利用小鼠自行车运动模型对父代运动的跨代遗传做了相关研究[31]：跑步者的雄性后代抑制了幼年恐惧记忆的恢复，并减少了成年后明暗箱实验中的焦虑，而这些情感行为在女性后代中无明显变化；跑步改变了精子中的miRNAs水平，其中包括三种独特的miRNAs(miR-19b、miR-455和miR-133a)和两种tRNA衍生的RNA(tDRs)(tRNA-Gly和tRNA-Pro)。这些均对RNA转录后的基因调节有重要作用，因此可改变大脑和相关情感行为的发育。

2.运动对代谢的影响：父代运动除了改善后代行为外，亦对代谢过程产生重要影响。自行车运动模型中运动的小鼠引起了DNA甲基化和精子miRNA含量的改变，以及雄性后代代谢过程的改变[32]。此外，研究者将肥胖雄性小鼠(通过高脂饮食诱导)进行游泳训练作为一种运动方式(其诱导体重减轻)，结果发现运动后的肥胖小鼠精子miRNA序列倾向于正常小鼠，且雌性后代的代谢过程能够恢复[33]。Denham[34]发现父代的运动训练会减弱精子中异常的microRNAs(其与高脂肪饮食及代谢功能障碍相关)；在肥胖的父代中，尽管其雌性后代肾脂肪堆积较多，血浆甘油三酯及胰岛素抵抗均较高，但运动干预能有效改善父代表观遗传的代谢后果：高脂肪引起的X染色体的精子miRNA的异常表达(miR-503、miR-542-3p和miR-465b-5p)，参与细胞周期调控、细胞凋亡及胚胎发育，而这些异常可通过8周的运动干预而修复；父代运动后其骨骼肌磷酸脱氢酶激酶4(Pdk4，葡萄糖代谢的重要调节剂)mRNA表达减少，而后代的骨骼肌中表达也相应下降，说明运动诱导的精子表观遗传再编程可能导致了后代的骨骼肌基因的表型和转录的改变。

(二)多样环境对后代表型的影响

1.多样环境对神经系统的影响：多样环境可增强突触可塑性、学习和记忆，并降低包括阿尔茨海默病在内的各种复杂疾病的风险[35-36]。Benito等[37]利用玩具(以隧道、住房和形状不同的物体)和轮子为小鼠创造多样环境的状态，发现相比于正常组，10周多样环境刺激后的雄性小鼠F0其海马LTP得到增强，并且其后代F1的海马LTP亦得到相应增强，且有较明显的认知优势；研究者将多样环境刺激后的精液中的RNA注入到受精的卵母细胞中，其后代的认知评分有明显增加；PCR测序发现在多样环境刺激后雄性小鼠的精液及大脑中其miRNA212/132水平增加并参与到跨代遗传中。

最近研究证实，选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)(常用抑郁症治疗方法)对抑郁小鼠的治疗作用在多样环境中作用最大[38]。研究者将抑郁样表型的C57BL/6J小鼠暴露于多样环境或应激状态后使用SSRIs治疗(21 d)，结果表明，在多样环境条件下治疗的小鼠抑郁样表型总体上得到改善，而在应激条件下治疗的小鼠显示出明显的恶化。此外，SSRIs能够诱导几种miRNA的上调，包括miR-135和miR-375。抑郁症患者的血液中和大脑中miR-135的水平下降，SSRIs治疗(CBT)后抑郁症患者的miR-135水平升高[39]。

2.多样环境对行为及代谢的影响：多样环境通过跨代遗传对后代行为及生理应激反应产生一定影响[40]。将成年C57BL/6J雄性小鼠(F0)暴露于多样环境或标准鼠房4周，使用高架十字迷宫和旷场实验测试8周龄雄性和雌性F1和F2后代的焦虑状态，使用强迫游泳试验评估抑郁相关行为；在基线水平和强迫游泳应激后，通过定量血清皮质酮和促肾上腺皮质激素(ACTH)水平来确定HPA轴功能。结果表明，多样环境刺激后的雄性后代F1和F2的体重增加，焦虑和抑郁相关行为没有显著改变，虽然F2的焦虑行为没有发生变化，但是这些小鼠在强迫游泳试验中显示出潜伏期缩短。

三、展望

以往人们认为父代对其子女的影响是由精子携带的遗传物质决定的，而它不受环境的影响。近年来大量研究表明，无论是不利的还是有利的生活环境都可通过sncRNAs介导跨代遗传而影响后代的生理和行为表型。相关机制可以为疾病发展过程提供理论依据，并为改善人类健康提供新的治疗方法。然而，对于理解跨代遗传还有许多问题需要解决，如精子表观基因组在复杂的环境中是怎样编码的，以及精子中的这些表观遗传修饰如何影响合子的发育及后代的行为。未来可通过系统地比较动物研究结果和临床数据，考察这些跨代遗传是如何进行的。