杜仲叶化学成分研究进展

吴红艳,彭呈军,邓后勤,*

(1.湖南农业大学食品科学技术学院,湖南长沙 410128; 2.慈利县九九农业开发有限公司,湖南张家界 427200)

杜仲(EucommiaulmoidesOliv.),又名胶木,为杜仲科植物,种植范围广泛,多分布在长江中游和南部各省,具有抗氧化、降血压、安胎、预防肥胖[1]、强筋健骨、改善糖代谢[2-3]、增强免疫力等功效[4-6],作为中药在中国已有上千年的历史。

然而,目前对于杜仲的开发利用并不全面,大多局限于杜仲皮和杜仲胶,一直以来杜仲主要以杜仲皮入药,杜仲胶也是一种天然高分子材料,可作为一种天然橡胶被广泛地应用于各行业领域,而资源更丰富的杜仲叶却一直缺乏有效的加工利用。现代研究表明,杜仲叶(Eucommia Folium)与杜仲皮有相同的有效成分和药理作用[7],目前经过分离和鉴定的有机化合物约有70种以上,无机矿物元素不少于15种,大致可分为环烯醚萜类、木脂素类、黄酮类、杜仲胶、苯丙素类、酚类、氨基酸、多糖类、脂肪酸和维生素。杜仲叶属可再生资源,产量巨大,若对其进行加工利用,既可弥补传统的药源不足,还可以把天然杜仲叶应用到各个领域,尤其是食品加工领域,利用杜仲叶多种生物活性,将其作为保健品原料和添加剂,开发出营养价值较高的功能性产品,这将对食品行业的发展起到积极的推动作用。本文对近年来杜仲叶化学成分的研究现状进行综述,以期为杜仲叶的进一步开发利用提供参考。

1 化学成分的研究

1.1 环烯醚萜类化合物

环烯醚萜类化合物性质不稳定,容易氧化分解,在新鲜的杜仲叶中含量较高,现已从杜仲叶中分离得到20多种环烯醚萜类化合物,主要包括车叶草苷、京尼平苷酸[8]、桃叶珊瑚苷、哈帕甙乙酸酯、筋骨草苷、杜仲苷、杜仲醇和雷扑妥苷。

张倩茹等[9]通过比色法测定环烯醚萜类化合物的含量,正交试验优选出最佳的提取条件,发现当料液比为1∶12 (g/mL)、85%乙醇作为溶剂时,在80 ℃条件下热回流提取3次,每次45 min,提取率最高,为0.507%。刘静等[10]用回流法、超声波法、微波法和浸提法提取桃叶珊瑚苷和京尼平苷酸,发现回流法提取率最高,桃叶珊瑚苷达58.79 μg·g-1,京尼平苷酸达107.96 μg·g-1,确定最佳提取方案为乙醇浓度60%、料液比1∶25 (g/mL)、提取4次。Bianco等[11]用硅胶和纤维粉层析法研究杜仲叶乙醇提取物,发现至少存在6种环烯醚萜类化合物,层析法纯化分离后发现其中四种为桃叶珊瑚苷、哈帕甙乙酸酯、筋骨草苷和雷扑妥苷,另外两种新的化合物仅在秋季存在于植物中,作者主要对极性化合物2-杜仲醇进行研究,发现该物质可产生乙酰基衍生物3,无OH吸收,并含有4个乙酰基,利用双共振技术简化结构,分离纯化得到环烯醚萜类化合物新戊烯基四萜醇。Hosoo等[12]用乙醇作为提取剂,通过水蒸气法提取杜仲叶中的京尼平苷酸和车叶草甙,测得提取物中的含量分别为65.8、11.4 mg·g-1,并发现提取物可改善内皮血管功能,动脉膜厚度(101.9±1.4) μm明显低于对照组(124.7±5.9) μm,血浆中NO水平(11.75±1.95) μm高于对照组(6.37±0.95) μm。Yang X等[13]以离子液体为提取剂,超声提取杜仲叶中桃叶珊瑚苷,确定在25 ℃条件下,浓度为0.5 mol/L的离子液体对桃叶珊瑚苷的提取效果最好,再用大孔吸附树脂富集纯化提取液中的桃叶珊瑚苷,得洗脱液中桃叶珊瑚苷的纯度为79.41%,回收率为72.92%。郑阳等[14]用30%的乙醇超声提取,95%的乙醇醇沉粗体液,减压浓缩得浓缩液,再用乙酸乙酯和正丁醇萃取浓缩液,大孔树脂分离、半制备色谱纯化,质谱、光谱、核磁共振等方法检测为杜仲醇,HPLC定量分析杜仲醇的纯度达95.12%。

以上采用的提取检测方法因提取物质不同各有优缺点,回流法提取所得产物的提取率高,稳定性好,比色法测定具有快捷、高效的特点,适用于环烯醚萜类化合物的提取,半制备液相色谱法可用于分离高纯度的单体,继而用于后续加工利用,操作方便,对于提取物的纯化大多采用大孔树脂,大孔树脂纯化可以提高有效成分分离效率,具有快捷、省时、低成本的特点。

1.2 木脂素类化合物

木脂素类化合物包括松脂素、橄榄脂素[15]、二氢脱氢二松柏醇、定向脂醇二葡萄糖苷等27种化合物。其中主要成分为松脂醇二葡萄糖苷(pinoresinol diglucoside,PDG),具有降血压的作用。

Gu J等[16]研究杜仲叶提取物和醛糖还原酶抑制剂对血管重塑的影响,发现木脂素可以逆转血管重塑,可能原因是抑制了醛糖还原酶的表达,因此,醛糖还原酶可能是木脂素用于治疗心血管疾病的靶点。郑雪等[17]用85%的乙醇超声提取新鲜杜仲叶,真空抽滤得滤液,用制备薄层分离纯化滤液得固体提取物,HPLC测定用制备薄层法分离得到的PDG产物溶液和除去溶剂后的PDG产物中的PDG含量,结果表明提取产物中的PDG含量比新鲜杜仲叶中的含量高40～50倍,该实验方法操作简单快捷,减少了溶剂用量,但由于其他组分存在导致薄层分离时PDG斑点难以分开,因此,木脂素类化合物分离方法还需要进一步研究。

1.3 黄酮类化合物

杜仲叶中黄酮类物质含量较高,在抗氧化、抗癌、预防吸血管疾病等方面具有显著效果。目前,已从杜仲叶中发现十几种黄酮,主要有槲皮素、槲皮素苷、紫云英苷、山奈酚、异槲皮甙、芦丁、陆地锦甙等。

贾征等[18]采用超声提取法,探讨了乙醇为溶剂提取杜仲叶黄酮的最佳提取条件为40%的乙醇,固液比1∶60 (g/mL),浸泡2.5 h后提取2次,每次1 h,并通过抗氧化研究发现,黄酮可抑制脂质过氧化和红细胞氧化溶血。王学军等[19]分别探究了超声提取法、微波提取法、热水回流提取法不同方法及甲醇、乙醇、水等不同提取溶剂对杜仲叶中绿原酸、芦丁、槲皮素、山奈酚的提取效果的影响,发现超声提取法耗时短,产率高,70%的甲醇提取效果较好。王志宏等[20]先用95%的乙醇超声提取,过滤提取液,再用 60%的乙醇超声提取滤渣,合并两次滤液,通过单因素和正交试验确定最佳提取工艺为料液比2∶1 (g/mL),水解温度80 ℃,水解时间3 h,盐酸浓度6 mol/L,黄酮苷元含量为2.512%,薄层色谱测得纯化后黄酮苷元含量为12.87%,HPLC测得二次纯化后的含量高达63.19%。许兰波等[21]以甲醇为溶剂,在100 W下超声提取杜仲叶黄酮,HPLC测定出6种黄酮:槲皮素-3-O-葡萄糖(1→2)葡萄糖苷、槲皮素-3-O-阿拉伯糖(1→2)葡萄糖苷、槲皮素-3-O葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷、槲皮素。Huang W等[22]为研究黄酮的抗氧化效果,用40%的乙醇超声提取杜仲叶黄酮,测得含量为17.2%,大孔树脂纯化后纯度为78.6%,发现黄酮对羟基的抑制效果为1.8%,还原能力最差,为0.6%,对大鼠红细胞溶血抑制效果为76%,对丙二醛的产生也具有良好的抑制效果,抑制作用最好的是脾脏,为99.12%。许先猛等[23]通过单因素试验,结合正交试验探讨了乙醇为溶剂超声提取杜仲叶黄酮的最佳提取工艺,结果表明在提取功率600 W、超声时间30 min、乙醇浓度60%、料液比1∶15 (g/mL)、提取2次的条件下,黄酮得率最高,为2.04%。柴建新等[24]在用60%的乙醇水浴提取、大孔树脂吸附与AL(NO3)3络合法测量杜仲叶黄酮的过程中,通过加入亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等试剂优化比色条件,减少分析时间,达到精确测量的效果,测得黄酮含量为4.86%。董兴叶等[25]采用亚临界水萃取杜仲叶黄酮类化合物,通过单因素及正交试验确定最佳工艺条件为:提取温度120 ℃、时间30 min、料水比1∶25 (g/mL)、压力1.0 MPa,黄酮类化合物得率为3.9%±0.06%。

超声辅助提取和微波辅助提取是提取杜仲叶总黄酮的常用方法,与其他方法相比大大缩短了提取时间,提高提取率,超声提取可在室温条件下进行,设备简单,操作方便,是提取黄酮的首选方法。对于黄酮类化合物化学成分的鉴定分离多采用色谱法,实验过程繁琐,实验要求高,但是结果精确。亚临界萃取法的相关研究较少,相较于传统水提法可大幅度提高提取率,是一种绿色环保、前景广阔的提取方法,因为亚临界水萃取需要在一定压力下进行,所以更适用于工业化生产。

1.4 杜仲胶

杜仲胶存在于杜仲树不同部位的含胶细胞中,为反式-聚异戊二烯[26],是一种天然的高分子物质,在杜仲叶中的含量相对较低。

龚兆全等[27]用碱浸法处理杜仲叶,正己烷-丙酮提取法提取杜仲胶,研究赤霉素(GA3)、萘乙酸(NAA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、6-苄氨基嘌呤对杜仲胶含量的影响,发现GA3处理的杜仲胶含量最高,2,4-D处理的杜仲胶含量最低,对生产加工中提高杜仲胶含量具有参考价值。Xia L等[28]采用冷热水和石油醚交替法提取杜仲胶,将提取出来的杜仲胶用于轮胎胎面设计,经机械处理后,在30 kDa范围内,测定橡胶试样的力学性能、拉伸强度、断裂伸长率等指标,发现与没有杜仲胶相比,热积累都有所增加。Takeno S等[29]比较索氏提取法和2 mL提取法提取杜仲胶的提取效果,索氏提取法是在120 ℃条件下加入100 mL乙醇提取10 h,之后在150 ℃条件下加入50 mL甲苯提取12 h,甲醇冲洗甲苯提取物中的残渣,称其重量;2 mL提取法是将15 mg杜仲叶粉末悬浮于1.2 mL乙醇中,以14000 r/min离心1 min,收集残渣,以甲苯为溶剂,提取杜仲胶;发现两种方法提取率几乎相同,前者为4.03%±0.29%,后者为4.01%±0.25%,RSD分别为7.11%和6.29%;并利用傅里叶变换红外光谱和热解-气相色谱/质谱定量测定,发现两种提取方法杜仲胶分子量分布几乎相同。刘慧东等[30]以减重法为原理采用滤袋技术测定杜仲叶中杜仲胶含量,结合索氏提取技术,设计正交试验研究滤袋孔径、样品重量和提取时间对提取率的影响,将杜仲叶粉末装入滤袋中超声洗涤40 min,再用石油醚索氏提取,确定最佳工艺参数为滤袋孔径25、10 μm,样品质量0.1～0.5 g,索氏提取60 min,与传统碱煮法测定杜仲胶提取率相比,滤袋技术所需的样品量较小,预处理步骤更简洁,节约成本,不仅可以快速测量杜仲胶的含量,而且测量结果更加接近真实值,可广泛应用于杜仲胶产业、杜仲胶育种、大量样本快速检测等方面。同时,滤袋法不需要大型仪器设备,操作简便易行,有利于产业化过程中对材料品质的估测。

1.5 苯丙素类化合物

苯丙素类是形成木脂素的前体,包括香豆酸、松柏酸、二氢咖啡酸、咖啡酸、丁香苷、间羟基苯丙酸、愈创木丙三醇等,目前对于苯丙素类的报道较少,大多集中在绿原酸、香草酸等活性成分方面,对绿原酸的含量和活性研究最多。

李旭等[31]通过响应面设计试验得出了杜仲叶绿原酸最佳提取工艺条件为料液比26∶1 (mL/g)、提取时间2.5 min、微波功率722 W、乙醇体积分数30%,在此条件下,绿原酸含量达到29.74 mg/g,且具有较好的降压效果。何念武等[32]比较了以乙醇为溶剂的溶剂提取法、水提取法、酶法、超声波辅助法和以水为助提剂的超临界流体萃取法5种方法对杜仲叶绿原酸的提取效果,发现水提取法绿原酸含量最低,超临界流体萃取法绿原酸含量最高,乙醇提取法是最佳选择。张蕾等[33]探讨了超声提取杜仲叶绿原酸的最佳工艺,发现在40%的乙醇、料液比1∶35、浸泡60 min的条件下,超声提取30 min,绿原酸得率最高,为8.0418 mg/g。张雪梅等[34]通过实验比较水提取法和酶提取法的提取效果,发现酸性蛋白酶提取所得的绿原酸含量最高,为26.4%,水提取的含量最低,为12.1%。杨凌等[35]研究了树龄、存储时间、阳光对杜仲叶绿原酸含量的影响,以40%的乙醇为溶剂水提杜仲叶绿原酸,发现树龄越大、存储时间越长绿原酸的含量越低,生长在阳坡上的杜仲叶绿原酸含量高于生长在阴坡上杜仲叶绿原酸的含量。张忠立等[36]使用色谱方法从杜仲叶中分离出9个苯丙素类化合物,分别为:咖啡酸、绿原酸甲酯、紫丁香苷、愈创木基丙三醇(4)、5-甲氧基-愈创木基丙三醇(5)、5,9-二甲氧基-愈创木基丙三醇(6)、9-正丁基-愈创木基丙三醇(7)、9-正丁基-愈创木基丙三醇(8)、8′-甲氧基-橄榄素(9),研究了杜仲叶和皮的差异性成分和特征性成分,为临床上“以叶代皮”提供理论基础。Shi X L等[37]用80%的乙醇回流提取杜仲叶,获得粗提物,再依次用氯乙烯、乙酸乙酯和正丁醇分离粗提物,经光谱分析得到两对苯丙素对映体,命名为化合物1和化合物2,两者均为无色胶状物质,核磁共振测得其结构中含有芳环、甲氧基,通过分析发现两者平面结构一致。

综上所述,对于绿原酸的提取大多采用乙醇作为提取剂,而对于提取方法,水提取虽然操作简单,实验方便,但是提取率最低,酶提取法因酶可以破坏叶片结构和细胞壁具有较好的提取效果,常用的提取方法为超声提取法和微波提取法,操作方便,节约成本。

1.6 多糖类物质及脂肪酸

杜仲叶中的多糖易溶于水,无味,为灰白色粉末,不溶于高浓度的有机溶剂。徐贤柱等[38]以杜仲叶为原料,水加热回流法提取杜仲多糖,苯酚-硫酸法测量杜仲粗多糖提取率为0.5245%,纯度为67.3%,研究发现多糖可以提高血清中白细胞介素和免疫球蛋白的含量,提高免疫力,但对胸腺功能无显著影响。雷燕妮等[39]采用水提醇沉法提取杜仲多糖,测得多糖提取率5.76%,多糖中总糖含量为75.3%,研究发现多糖可以改善血脂水平,降低动脉硬化和冠心病的发生风险,揭示了降血脂的作用机制,对杜仲叶降血脂的研究进行了补充。Tomoda等[40]通过水提取法提取,乙醇沉淀,硫酸钠溶溶解沉淀,十六烷基溴化铵处理溶液,色谱分析法分析杜仲糖B聚糖,发现含有L-阿拉伯糖(13.5%)、D-G和ICTOSE(8.5%)、L-鼠李糖(34.1%)、D-半乳糖醛酸(42.9%)和肽部分(1%),全面分析了聚糖的结构。黄伟等[41]利用水回流法提取出杜仲叶酸性多糖EOP-1,经柱层析梯度洗脱、乙醇沉淀、丙酮洗涤,获得最佳脱蛋白、脱色方法为Sevage脱蛋白法和过氧化氢脱色法,利用高效凝胶渗透色谱分析发现多糖EOP-1主要有鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖,是一种酸性多糖,分子量约为6.0×105Da,是杜仲叶中首次发现的多分支酸性杂多糖。

安秋荣等[42]以乙醚、正己烷、NaOH甲醇溶液作为衍生剂,提取杜仲叶脂肪酸,毛细管气相色谱-质谱测定出10种脂肪酸,分别为豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、十六烷酸、亚油酸、亚麻酸、花生酸、山嵛酸、二十三烷酸、二十四烷酸,亚麻酸含量最高45.85%,豆蔻酸含量最低0.30%。

杜仲叶多糖的提取过程较为复杂,水提取回流法是常用提取方法,简便易操作,重现性好,节约成本,用乙醇醇沉、硫酸钠溶解沉淀,提取过程大致分为提取、过滤、离心、浓缩、沉淀、溶解等六个步骤,对于多糖的测量多采用色谱法,实验流程操作快捷,结果精确。杜仲叶脂肪酸提取研究较少,仍需进一步的研究。

1.7 氨基酸

杜仲叶中含有15种氨基酸,游离氨基酸极少,主要包括苏氨酸、蛋氨酸、精氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、谷氨酸等,其中精氨酸和组氨酸含量较高。

周芳等[43]使用GC-MS/SIM的方法测定杜仲叶中氨基酸的含量,盐酸提取杜仲叶,提取液经BSTFA+1% TMCS衍生化后进样,全扫描定性,使用内标法定量,实验结果表明氨基酸线性关系良好,回收率较高,同时,测定4个产地杜仲叶中氨基酸的含量,共发现15种氨基酸,7种为人体必需的氨基酸,色氨酸由于在酸性条件下被破坏,未检测出。Huang R H等[44]利用核磁共振波谱法测定了杜仲叶中提取物抗真菌肽(EAFP2)在水溶液中的三维结构,得出EAFP2是一种三级结构,包含一个域、一个疏水键和一个特色部分形成的氨基端残留物和羧基端通过二硫键Cys7-Cys37交联。

氨基酸的测定方法有很多,其中,电化学法具有干扰背景大、非电化学活性的氨基酸仍需进一步衍生化反应等缺点,氨基酸自动分析仪价格昂贵、实验成本高,薄层色谱法定性定量不够准确,因此实际应用受到限制,而本文提到的色谱质谱联用法可以有针对性的选择目标化合物,具有简便灵敏、重现性好、准确度高等优点,适用于杜仲叶中氨基酸的分离检测。

1.8 维生素、微量元素和其他成分

杜仲叶中含有丰富的维生素和胡萝卜素,还含有维生素B2和微量的维生素B1,这与杜仲的抗衰老以及细胞免疫能力息息相关。杜仲叶含有15种矿物质元素,包括锌、铜、铁等微量元素和钙、钾、磷、镁等宏量元素。杜仲叶中还含有其他成分,如地芰普内酯、酒石酸、β-谷甾醇、胡萝卜苷等35种挥发性成分,还含有生物碱葡萄糖乙甙等。

林杰等[45]利用顶空固相微萃取法(HS-SPME)结合气相色谱质谱联用技术(GC-MS)分析了杜仲和杜仲叶中挥发性化学成分,从杜仲叶中分离出了40种化学成分,鉴定出19种,占挥发性成分总含量的94.72%,其中含量较高的为壬醛13.53%、1-石竹烯10.36%,具有抗炎、局麻等作用,醋酸含量为3.47%;从杜仲中分离出39种化学成分,鉴定出13种,占挥发性成分总量的96.83%,其中含量较高的为壬醛17.47%,葵醛8.85%,具有抑制细菌的作用,正戊醇含量为6.37%;二者共有的成分为壬醛、樟脑和己醛。杜仲叶中部分化学成分在杜仲中没有发现,因此杜仲叶代替杜仲入药时应慎重考虑。

2 展望

传统多以杜仲树皮入药,造成了杜仲资源的破坏,通过对杜仲叶的研究,发现杜仲叶活性成分丰富,与杜仲树皮具有相似的化学成分,有代替杜仲皮的潜力。近年来,研究者主要对杜仲叶活性成分的提取分离及药理作用进行了深入研究,以本文综述的杜仲叶绿原酸和黄酮为例,杜仲叶中绿原酸和黄酮含量高,提取分离方法多样,同时具有良好的生物活性,可作为一种很好的天然植物活性成分来源,除此之外,杜仲叶中可提取利用的还有桃叶珊瑚苷、咖啡酸等多种成分,既发挥了杜仲叶含有的这些功能性成分的优势,又充分利用了杜仲叶资源。

杜仲叶的资源十分丰富,但并未得到有效的开发利用,例如在临床上的应用范围较窄,很多试验缺乏科学依据,且杜仲叶的成药品种少,还未开发出更好的药品,这就要求在未来的研究过程中将杜仲叶的药理作用机制研究透彻,使其得到最大化的利用。笔者认为,对于杜仲叶的深度开发,有两种发展趋势。第一,可充分加工利用提取有效成分之后的杜仲叶残渣,减少杜仲叶资源的浪费。第二,以杜仲叶为原料开发出具有保健功能的产品,例如杜仲茶、杜仲饮料等。同时,未来对于杜仲叶的研究应更加全面化、系统化、条理化,开发出更多的杜仲叶食品、保健品和药品。