大秃马勃培养基配方的优化

史 鑫，王宏杰，王鸿磊，丁 强，王红艳

(中国农业大学 烟台研究院，山东 烟台 264670)

大秃马勃(Calvatiagigantea)又名马粪包，大马勃，属真菌界担子菌门伞菌纲伞菌科秃马勃属真菌[1-3]。子实体近球形至球形，直径15～36 cm或更大，不孕基部无或很小，常单生或群生于草地上，我国东北、华东及西南等地均有分布[4-6]。大秃马勃子实体幼时白色，可以食用，味道鲜美，其蛋白质含量高达31.27%，远高于香菇、金针菇和平菇等食用菌，且含有丰富的矿物质，是一种珍稀的食用真菌[7-8]。大秃马勃也是一种重要的药用真菌，具有清热解毒、抗炎止血及抗癌抗肿瘤等功效[9-14]，其药用价值在《本草纲目》中有记载，在《中国药典》(2005 版)中被列为3种正品马勃之一[15]。

大秃马勃是一种极具开发潜力的食药用真菌，但目前仍然靠人工采摘野生资源为主，远不能满足其在食品和医药领域的需要，发展大秃马勃人工栽培势在必行。目前，大秃马勃的研究主要集中在抗肿瘤[16]、抗氧化[17]等生药学方面和菌丝液体发酵[18]方面，对人工栽培的研究也仅限于仿野生栽培[19]，其生产周期长，产量低，尚没有工厂化栽培的记录。笔者所在课题组自野外采集到野生大秃马勃1株，计划对其生物学性质、种子制备、栽培方法等进行系统研究，以实现大秃马勃的工厂化栽培。前期研究发现，大秃马勃菌丝在普通PDA培养基上生长缓慢，其生长速度为1.179 4 mm/d，导致人工培养周期过长(>20 d)。鉴于此，利用响应面法对大秃马勃菌丝培养基配方进行优化，旨在为缩短大秃马勃菌种培养时间，提高其菌丝生长速率并实现工厂化生产提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 大秃马勃菌种 分离保藏于中国农业大学烟台研究院微生物研究室。

1.1.2 培养基 PDA培养基(马铃薯20 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL)和基础培养基(土豆浸粉6 g,KH2PO42.0 g,MgSO40.5 g,琼脂20 g，水1 000 mL)，自制。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种活化 将大秃马勃菌种接种于PDA培养基平板上，在24℃恒温避光培养20 d，用Φ5 mm打孔器打取菌丝块备用。

1.2.2 不同因素对大秃马勃菌丝生长的影响

1) 最佳碳源。试验设4个处理，即在基础培养基中分别添加20 g/L的葡萄糖、蔗糖、红糖和可溶性淀粉。将大秃马勃菌丝块接种于碳源筛选培养基平板上，每个处理接种1块，6次重复，24℃培养，从第9天开始，每2 d测量1次菌落直径，计算菌丝生长量。以菌丝生长量最大、菌丝最为浓密的碳源为最佳碳源。

菌丝生长量=(菌落直径-菌丝块直径)/2

2) 最佳氮源。试验设7个处理，在最佳碳源培养基中分别添加5 g/L的蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、豆饼粉及黄豆粉。将大秃马勃菌丝块接种于氮源筛选培养基平板上，每个处理接种1块，6次重复，24℃培养，从第8天开始，每2 d测量1次菌落直径，计算菌丝生长量。以菌丝生长量最大、菌丝最为浓密的氮源为最佳氮源。

3) 淀粉浓度。试验设5个处理，即在5 g/L豆饼粉+6 g/L土豆浸粉+2.0 g/L KH2PO4+0.5 g/L MgSO4+20 g/L琼脂组成的培养基中分别添加10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L及30 g/L淀粉。每个处理接种1块，6次重复，24℃培养，观察菌丝生长情况，当有1个平板的菌丝长到接近9 cm培养皿边缘时试验结束(下同)，开始测量菌丝生长量，记录培养时间，确定最佳淀粉浓度。

4) 豆饼粉浓度。试验设5个处理，即在15 g/L淀粉+6 g/L土豆浸粉+2.0 g/L KH2PO4+0.5 g/L MgSO4+20 g/L琼脂组成的培养基中分别添加1 g/L、3 g/L、5 g/L、7 g/L和9 g/L豆饼粉。每个处理接种1块，6次重复，24℃培养，观察菌丝生长情况，记录培养时间，确定最佳豆饼粉浓度。

5)土豆浸粉浓度。试验设5个处理，即在15 g/L淀粉+7 g/L豆饼粉+2.0 g/L KH2PO4+0.5 g/L MgSO4+20 g/L琼脂组成的培养基中分别添加2 g/L、4 g/L、6 g/L、8 g/L和10 g/L土豆浸粉。每个处理接种1块，6次重复，24℃培养，观察菌丝生长情况，记录培养时间，确定最佳土豆浸粉浓度。

1.2.3 响应面法优化大秃马勃菌丝培养基配方 根据单因素试验结果确定影响大秃马勃菌丝生长的试验因素，选择豆饼粉(A)、淀粉(B)和土豆浸粉(C)3个因素为自变量，以菌丝生长量为响应值(Y)，采用3因素3水平的Box-Behnken响应面分析法筛选大秃马勃培养基最优配方；通过试验结果进行多项式拟合回归和方差分析，根据模型方程绘制大秃马勃菌丝生长响应面曲面图及等高线，并根据响应面曲线的陡峭程度及效应面的等高线形状确定最优配方组合。

1.3 数据统计与分析

利用SPSS 13.0和Origin 7.5进行数据分析和绘图，利用Design-Expert 7.1.3进行响应面法试验设计与分析。

2 结果与分析

2.1 不同因素处理大秃马勃菌丝的生长量

从图1可见，不同碳源、氮源和不同浓度的淀粉、土豆浸粉和豆饼粉对大秃马勃菌丝的生长有不同程度的影响。

2.1.1 碳源 大秃马勃菌丝在以淀粉和蔗糖为碳源的培养基上生长速度较快，培养至第17天时部分平板的菌丝已接近培养皿边缘，二者平均菌丝生长量相当，分别为2.931 cm和2.795 cm，但以淀粉为碳源培养的大秃马勃菌丝密度更大，所以选择淀粉为培养大秃马勃菌丝的最佳碳源。

2.1.2 氮源 大秃马勃菌丝在以豆饼粉和黄豆粉为氮源的培养基上生长速度较快，培养至第18天时，以豆饼粉为氮源培养的大秃马勃菌丝生长量和菌丝密度均最大，其生长量为2.703 cm，所以选择豆饼粉为培养大秃马勃菌丝的最佳氮源。

2.1.3 淀粉 随着淀粉浓度增大，大秃马勃菌丝生长量呈先升后降趋势。其中，当淀粉浓度为15 g/L时菌丝生长量达最大，为3.371 cm；继续增大淀粉浓度则菌丝生长量反而下降。因此，最佳淀粉浓度以15 g/L为宜。

2.1.4 土豆浸粉 土豆浸粉对大秃马勃菌丝生长的影响趋势与淀粉的基本相同，也呈先升后降趋势。即随着土豆浸粉浓度增大大秃马勃菌丝的生长量呈上升趋势，当浓度为6 g/L时菌丝生长量达最大，为3.386 cm；浓度继续增大则菌丝生长量下降。因此，最佳土豆浸粉浓度以6 g/L为宜。

2.1.5 豆饼粉 豆饼粉对大秃马勃菌丝生长的影响趋势与淀粉和土豆浸粉基本相同，亦呈先升后降趋势。当豆饼粉浓度为1～7 g/L时大秃马勃菌丝的生长量呈上升趋势，并在浓度为7 g/L时达最大，为3.803 cm；继续增大豆饼粉浓度则菌丝生长量下降。因此，豆饼粉浓度以7 g/L最佳。

图1 不同因素处理大秃马勃菌丝的生长量Fig.1 Effect of different factors on mycelia growth of C.gigantean

2.2 大秃马勃菌丝培养基的最优配方

从表1可见，处理4的菌丝生长量最大，为3.925 cm，其次是处理9和处理5，分别为3.890 cm和3.875 cm；处理1最小，为2.905 cm。对试验结果进行多项式拟合回归得二项式拟合方程为各处理菌丝生长量(Y)进行二次回归拟合，得方程Y=-0.38+0.34A+0.32B+0.29C+0.05AB+0.02AC+0.002 5BC-0.08A2-0.025B2-0.04C2。其中，模型P=0.002 3(<0.01)，拟合不足P=0.163 9(>0.05)，R2=0.934 2，说明，通过响应面法拟合所得二次回归模型与实际值拟合度高，模型回归达极显著，模型与试验各因素相关度好，试验方法可靠且误差小，能够很好地分析和预测大秃马勃菌丝的生长量。豆饼粉的二次项(A2)及豆饼粉与淀粉的交互作用(AB)的P值分别为0.000 3和0.006 0，均<0.01，说明，二者对菌丝生长量的影响达极显著水平；豆饼粉(A)、淀粉(B)及土豆浸粉二次项(C2)的P值分别为0.013 1、0.034 5和0.015 0，均<0.05，说明，三者对菌丝生长量的影响达显著水平；各因素对大秃马勃菌丝生长量的影响依次为A2>AB>A>C2>B>B2>C>AC>BC。

表1 大秃马勃菌丝培养基配方的响应面试验方案与结果Table 1 The scheme and results of the response surface experiment for optimizing medium formula in mycelia growth of C.gigantean

从图2可知，3个响应面均为开口向下的凸形曲面，说明，响应值存在极高值。响应曲面的等高线中心均位于-1～1，说明，菌丝生长的最优条件存在于所设计的因素水平范围之内。3组交互效应的等高线形状均为椭圆形，表示各因素的交互作用显著。由此确定大秃马勃菌丝培养基的最佳配方为2.0 g/L KH2PO4+0.5 g/L MgSO4+20 g/L琼脂+7.10 g/L豆饼粉+14.11 g/L淀粉+6.00 g/L土豆浸粉，在此条件下菌丝生长量预计最大可达3.87 cm。根据最佳配方配制培养基对模型进行3次以上验证试验的结果表明，菌丝培养时间为11 d时平均菌丝生长量达3.795 cm，与预测值相比误差为1.94%。说明，该试验建立的因素与响应值的回归模型科学合理，可以较好地预测大秃马勃菌丝生长量。优化后大秃马勃菌丝的生长速度为3.45 mm/d，为优化前的2.93倍，极大地提高了大秃马勃的培养效率。

图2 不同因素下大秃马勃菌丝生长量的响应面和等高线Fig.2 Response surface and contour line of mycelia growth of C.gigantean under different factors

3 结论与讨论

大秃马勃是一种珍稀的食药用真菌，具有广阔的食品和医药开发价值[20-21]。由于野生资源有限，人工栽培是大秃马勃开发的必由之路。研究结果表明，大秃马勃菌丝培养的最优培养基配方为豆饼粉7.10 g/L、淀粉14.11 g/L、土豆浸粉6.00 g/L、KH2PO42.0 g/L、MgSO40.5 g/L及琼脂20 g/L。此条件下菌丝生长速度达3.45 mm/d，培养时间缩短至11 d，平均菌丝生长量达3.795 cm。