4D生物打印技术的研究进展

白凯淞，陈光华，由长城，闫景龙

(哈尔滨医科大学附属第二医院骨外科，哈尔滨 150001)

再生医学是医学的一个分支，包括组织工程、治疗性干细胞及人造器官的运用[1]。其中，组织工程可制造用于修复受损或病变组织的人造组织[2]。3D打印技术于1986年由赫尔公司获得专利，此后研究者们开发了大量的3D打印技术[3]。在构建非生物支架和细胞的复杂聚合结构时，最有效的方法为3D打印和3D生物打印，前者是在非生命物质上进行计算机辅助构建，后者即3D打印生命体[4]。然而，目前3D打印/生物打印技术具有很多局限性，如在打印体分辨率、生物兼容性、细胞活性及机械性能等方面无法兼顾[5-6]。4D生物打印技术是近年来发展起来的一种技术，可以使人造组织具有环境响应性[7]。4D生物打印技术包含了利用形态转化的各种生物制造方法，如溶剂浇铸、旋涂/浸涂、光刻等。该技术的根本思路是先制作一个3D结构，然后改变它的形态。这种形态转化与物体的三维空间维度(x,y,z)的额外维度(时间)有关[8]。此技术可以弥补3D生物打印的不足，从而更准确地模拟原生组织的动态变化。现就4D生物打印技术的研究进展予以综述。

1 形态转化方法

改变制造体形态的方法有很多，可以人工完成，也可使用具有变形特性的材料，现分别介绍如下。

1.1自发形态转化 利用材料内应力引起自发形态转化是4D生物打印技术的一种主要方法。如由不同性质的金属及其氧化物构成的无机双层晶体，通常具有因晶格失配而产生的内应力，从而引起形态转化[9-10]。利用材料内应力引起自发形态转化的优点为可通过折叠由光刻法制备的零件来制造微小三维结构，而缺点为结构在制造后会直接发生形态转化，即须将细胞填充于已发生完全形变的结构中，无法利用形态转化来制造三维细胞结构，且金属及其氧化物通常无法生物降解，故限制了其应用。而使用水凝胶可解决金属及其氧化物无法生物降解的问题[11]。如Jamal等[12]研究发现，聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)双分子层可发生自发形变，因其两层具有不同的溶胀系数。利用PEG双分子层自发形变可将细胞封装于水凝胶内，但难以通过外界信号引发形态转化。由于PEG链可将生物降解的酯基连接到主聚合物链上，故认为这种聚合物也是可生物降解的，但不会降解为单体，而是降解为单独的水溶性聚合物链。

通常，所有基于自发形态转化方法的缺点为难以控制打印体折叠。

1.2使用环境响应性材料控制形态转化 控制物体形态转化最复杂但最有前景的方法为使用环境响应性材料[13]。其优点包括：①可以更好地控制形态转化；②可以同时折叠多个物体；③可以折叠更微小的结构。在4D生物打印中，使用环境响应性材料与自发形态转化法中使用内应力材料的概念非常相似，但不同的是，使用环境响应性材料可以通过控制环境刺激精确控制产生或释放内应力及形态转化的时间，而材料内应力无法被精确控制。这些优点为环境响应性材料在4D生物打印中的应用提供了广阔的发展空间。

虽然环境响应性材料有很多，但刺激条件却有很大限制[14]。如pH改变或紫外线会对细胞活性造成影响，这种刺激不可取[15]。有学者通过研究发现，可调节而又不影响细胞活性的条件为温度(4～40 ℃)[16]、Ca2+水平[17]、磁场[18]及声波[19]等。

1.2.1温度敏感型水凝胶 具有可变溶胀性质的温敏聚合物可用于制作水凝胶。在最早关于生物制造中应用环境响应性聚合物的报道中，聚N-异丙基丙烯酰胺[20]就已经被使用。基于此聚合物制作的水凝胶表现出低临界相转变温度的特性，即在低温下，聚N-异丙基丙烯酰胺水凝胶在水中溶胀，并随温度升高而收缩。这种特性已被用于制造双层结构，此结构可分别在低温和高温下进行可逆折叠或展开，并被用于细胞封装[21]。虽然基于聚N-异丙基丙烯酰胺的温敏水凝胶为4D生物打印提供了广泛的可能性，但它却有致命的缺点——聚合物疏水，无法生物降解，且在温度升高时生物相容性变差。

近年来，美国食品药品管理局批准可以将聚乳酸-羟基乙酸[poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA]用于临床试验。因此，PLGA/PEG/PLGA三嵌段共聚物(PLGAm-PEGn-PLGAm，其中m与n值分别代表PLGA与PEG的分子量)温敏水凝胶受到研究者们的重视，其降解产物PLGA与PEG可完全生物降解[22-23]。这种聚合物具有反向溶胶-凝胶的特性，即在低温时溶胶，在体温时凝胶，已应用于递送药物[23]。它可以在低温时被注射入体内某处，在体温下便可发生形态转化，且凝胶后可形成多孔型结构，有利于细胞代谢[24]。

1.2.2Ca2+敏感型水凝胶 Kirillova等[17]制作出一种藻酸盐/透明质酸凝胶，该凝胶具有环境响应性，且可封装细胞。这种凝胶是具有羧基的多糖，且它的溶胀性质取决于溶液中多价离子(Ca2+)的水平。同时该研究表明，细胞可以耐受细胞外环境中Ca2+水平的变化，Ca2+可作为一种具有“生物相容性”的刺激条件来诱导形态转化。基于以上研究结果，他们将甲基丙烯酸酯化聚合物及光引发剂与细胞一同打印出来，并用可见光照射它们以形成水凝胶。这种甲基丙烯酸酯化聚合物顶层在交联过程中开始干燥，导致顶层和底层的交联密度不同，从而引起水凝胶与无Ca2+细胞培养基中的细胞折叠，而改变Ca2+水平会使其展开。通过控制Ca2+水平来控制形态转化是4D生物打印最有前景的方法之一，因为Ca2+敏感型水凝胶可以与生物打印结合使用，可生物降解及生物相容，且可以将细胞附着于聚合物表面或封装于内部。

1.2.3磁响应材料 磁响应材料由磁性微粒子或纳米粒子组成，包括能响应于磁场的铁磁性粒子及顺磁性粒子。Zhang等[18]将介孔Fe3O4纳米颗粒与PEG组合形成磁响应材料，可用于控制多柔比星的释放。其中，一些磁响应材料已用于3D打印的墨水中。Tasoglu等[25]研究表明，PEG水凝胶是在磁场作用下通过自由基顺磁性在凝胶中组装而成。同时，他们将明胶甲基丙烯酰或载有细胞的明胶甲基丙烯酰浸没在稳定的自由基溶液中，使水凝胶顺磁化，从而可以在磁场的影响下进行形态转化。此外，维生素E可作为自由基清除剂，降低凝胶的磁性[26]。这种磁场响应行为模式可用于4D生物打印中，并可以安全和快速的方式操纵载有细胞的打印体。

1.2.4声响应材料 声波可能会引起材料进行物理或化学变化，特别是在高能量下[19]。Naseer等[19]研究表明，可利用声波以准确、快速和非接触的方式对细胞进行图案化来进行形态转化。且声波也已用于在时间与空间上控制水凝胶药物释放。如Huebsch等[27]开发了一种基于藻酸盐的声敏水凝胶。这种声敏水凝胶有作为4D生物打印生物墨水的潜力，因为藻酸盐已被广泛用作3D生物打印墨水材料[28]。可见，由声敏生物墨水制成的4D生物打印结构能以安全无创的方式进行形态转化。

1.2.5形状记忆聚合物 形状记忆聚合物是一种通过化学或物理方法交联，并在变形状态下被冷却到熔点或玻璃化转变温度以下，且可以生物降解的新型材料[29]。当温度升高到熔点或玻璃化转变温度以上时，形状记忆聚合物就会变形，且可以进行非常复杂的折叠[30]。固体形状记忆聚合物的缺点是细胞只能附着于表面而无法封装于内部。这个问题或许可以通过使用形状记忆水凝胶来解决，但目前仍无使用形状记忆水凝胶来进行生物制造的实例。在使用形状记忆聚合物进行4D生物打印时，主要的缺点为需要进行人工形态转化，如果样品体积很小，将会非常困难[29]。

1.2.6具有溶胶-凝胶转变特性的材料 使用凝胶的溶胶-凝胶转变特性来控制形态转化是4D生物打印极具前景的方法之一[16]。明胶是通过胶原水解获得的天然聚合物。交联明胶的溶胀性质与温度无关，但其水溶液具有在30～37 ℃发生溶胶-凝胶转变的特性。即明胶在冷水中溶胀但在温水中溶解，这种特性可用于触发形态转化。Stroganov等[16]在明胶-聚己内酯双层的实例中证实了这种效果。先将明胶-聚己内酯双层结构于冷水中进行不可逆折叠，再用紫外线光通过光掩模照射，使明胶-聚己内酯双层聚合物在某些位置发生交联。通过有机溶剂漂洗除去非交联聚己内酯，而未交联明胶被保留。将这种双层结构浸入冷水，交联和非交联明胶会发生溶胀。此时，非交联明胶会维系双层结构并防止其折叠，由于结构稳定，细胞可被附着于双层结构上。当温度升高至33 ℃时，非交联明胶会发生溶解，从而导致双层结构发生形态转化。该方法的优点是可以使用任何具有溶胶-凝胶转变特性的聚合物代替明胶，用任何疏水聚合物和水凝胶代替聚己内酯。

1.3细胞收缩介导的形态转化 附着在基质上的细胞能够产生牵引力。Kuribayashi-Shigetomi等[31]通过控制细胞牵引力来制造自折叠细胞结构。首先制作由柔性接头相互连接的微型板，再将细胞种植在微型板上。细胞通过其牵引力使柔性接头发生形变，从而使微型板折叠。控制折叠不依赖于微型板上的细胞数量，而是通过控制柔性接头的宽度与厚度精确地控制折叠。增加宽度可增大折叠角度，增加厚度可提高接头的强度，当接头厚度超过一定程度时，细胞牵引力不足以折叠此接头，所以可通过调节接头厚度来控制折叠。这种方法的优点是用细胞来控制材料折叠，更符合细胞生物学行为，且材料选择广泛度高。但缺点为折叠必须依赖于细胞生物学行为，须兼顾形态转化和细胞行为，限制了其应用自由度。

1.4人工形态转化 改变物体形态最简单的方法是人工形态转化，但此方法是否可以被归类于 4D生物打印技术，目前尚存在争议。有研究表明，可以手动将细胞膜片[32]或有细胞吸附的聚合物薄膜[33]缠绕在一种棒状结构周围来制造管状结构，棒状结构可以由玻璃、聚苯乙烯或琼脂糖制成，移除棒状结构后即可形成管状结构。将拉伸橡皮筋作为细胞附着的基质，释放橡皮筋时它会折叠并形成管状结构，这是一种更先进的形态转化方法[34]。而将拉伸橡皮筋应用于含细胞的静电纺丝膜，是该方法的一种改良。释放橡皮筋会使静电纺丝膜发生旋转形变[35]。人工形态转化方法的一大优点为它几乎可以应用于任何类型的材料，缺点为仅可以制造结构简单且体积较大的物体。

2 4D生物打印形态转化方式

将形态转化用于4D生物打印主要有3种方式[36]：①首先制造非生物构建体，再转化其形态，最后填充细胞于物体表面，类似于传统支架的制作方法；②首先制造非生物构建，再填充细胞于物体表面，最后转化形态；③同时构建非生物材料与细胞复合体，即细胞封装于物体内部，再转化形态。

其中，活细胞对材料选择、制造方式，以及形态转化条件的限制最为苛刻，且非生物材料必须具有良好的生物相容性和细胞黏附性并无毒害。由于第一种方式是在三维物体发生形态转化后，再将细胞植入其内，所以可用各种加工条件(温度、极端pH、激光、金属离子、有机溶剂等)的材料。然而这种方式因为没有利用形态转化来制造三维细胞结构，即物体发生形态转化后，很难实现在物体表面填充以及精确附着不同种类细胞，前景欠佳。在第二种方式中，细胞已附着于形态转化的材料表面，材料形态转化可形成三维细胞结构。在此方法中，材料必须具有良好的生物相容性，且形态转化所需条件必须适合细胞生存。而在填充细胞前，均可以在任何条件下加工和处理变形材料。第三种方式最具挑战性，是用已封装细胞的物体进行形态转化，对材料的制造及形态转化条件均严格限制。且后两种方式均为使含有活细胞的物体形态转化，是最有前景的4D生物打印形态转化方式。而后两种方式的区别在于，前者细胞附着在物体表面，而后者细胞封装于物体内部。

3 材料加工方法

与其他制造技术一样，4D生物打印技术的材料加工方法也可基于减材、增材和等材制造原理。最早的变形材料是用切削加工而成，可以归于减材制造[37]。随后出现的光刻技术更加先进，采取多层材料堆积交联，再去除非交联材料，即光刻法也可以归类为减材制造，优点为分辨率高[38]。另一方面，光刻法需要使用特殊的光掩模，制造复杂多层结构需要材料多次循环堆积，再经光掩模照射，最后去除多余材料，这导致在复杂多层结构内部封装活细胞极其困难，所以光刻法通常应用于形态转化的第二种方式。等材制造也称成形制造，如将聚合物溶液在具有特定形状的孔中干燥以形成特定形状结构[39]。然而，成形制造对细胞活力影响较大，无法应用于4D生物打印。3D打印具有组合不同材料的优点，并可使用上述3种形态转化方式，其基于挤出法的打印技术通常用于制造形态转化结构，而立体光刻法的缺点在于难于组合不同种类的材料[17]。在各种制造方法中，增材制造即3D打印技术的制造灵活性最高。

4 应 用

4D生物打印为生物材料的发展开辟了新道路，目前已用于模拟管状结构和各种微组织中。

4.1模拟管状结构 管状结构是形变物体最重要的结构。管状结构虽然简单，但在人体中起着非常重要的作用。人体许多组织器官均有管状结构，如血管、腺体和皮质骨等。因此，开发制造血管为应用4D生物打印最重要的方向之一[34-35]。多层管状结构仿制的血管结构可通过手动缠绕或释放拉伸橡皮筋等方法实现，但目前用此方法制造的结构紧致度不足，无法承受血液压力。另一个难题为制造血管网，目前只制造了单一直管结构。Kutikov等[33]开发出一种由含细胞电纺膜经人工缠绕设计形成的结构，并描述了它在修复骨缺损中的应用。皮质骨具有同心圆式结构和内部血管，运用人工缠绕法则是模仿皮质骨的结构。而使用常规3D生物打印需要高分辨率，且会降低细胞活性，制造这种结构相当困难[40]。

4.2模拟其他组织 Park等[41]提出了一种利用4D生物打印技术设计人工胰腺的方法。该研究使用形态转化的方法将胰腺β细胞封装于一种多孔镍铬金属容器内，方孔大小为8 μm×8 μm，细胞无法通过小孔逃逸，且小孔为细胞的物质运输提供了自由通道。容器被固定在海藻酸盐薄片上，然后通过人工滚动形成卷轴式结构。此完整结构能够释放胰岛素，释放量由葡萄糖水平控制。同时，4D生物打印还可用于制造各种细胞支架，这种细胞支架可以在适当条件下发生形态转化。Montgomery等[42]描述了一种形状记忆支架在功能性组织微创传输中的应用，通过1 mm的微孔递送支架和心脏补片(1 cm×1 cm)，支架与补片可在递送后恢复其初始形状，显著改善心肌功能。

4D生物打印技术虽然刚刚起步，但在组织工程及其他生物医学领域中具有非常广阔的应用前景。且这种先进制造理念与智能可变结构可以利用自然力或人为刺激来制造理想结构并达成预期目的。

5 小 结

自1986年起，3D打印技术及3D生物打印技术的发展取得了显著进步。4D生物打印技术是一种新兴且极具前途的组织工程方法。与传统3D生物打印相比，4D生物打印的主要优点为形成了二维结构(平面层)，并通过形态转化成为三维结构。制造单层结构无需高分辨率，而直接打印三维管状结构需高分辨率，且会对细胞活性产生负面影响。同时，将高密度的细胞附着在平面结构的表面很容易，而直接打印含有高密度的细胞的结构非常困难。因此，4D生物打印技术具有许多优势，它通过使用各种手段，以一种可控的方式，对打印结构进行形态转化，从而制造理想结构。虽然目前全世界已在 4D生物打印技术方面取得了很大进步，但仍然存在许多难题亟需解决。①在用于4D生物打印的各种材料中，环境响应性水凝胶是最有前景的，但环境响应条件温和、具有良好的生物相容性及生物降解性的却非常少。PLGA-PEG-PLGA温敏水凝胶符合上述条件，已广泛应用于科学研究及临床，具有广阔的应用前景[22-24]。②是形态转化后的形状。4D生物打印技术的潜在应用之一是制造血管，但目前仅报道制造出单一直管，尚无制造分支血管网的案例[34-35]，有待于进一步研究。③是打印结构的机械性能。因为打印结构通常不是紧密封闭的，所以不能承受血压。或许能够通过改良材料或技术，或者通过细胞分泌细胞外基质来改善机械性能。未来随着研究的进展和技术的进步，相信4D生物打印技术的应用会越来越广泛。