抗心肌缺血再灌注损伤多肽类药物的研究进展

何小奇，邓 莉

(广东医科大学寄生虫学教研室，广东 湛江 524023)

心血管疾病尤其是缺血性心脏病严重威胁人类健康。有90%以上的缺血性心脏病是由冠状动脉狭窄、堵塞引起[1]。冠状动脉长时间堵塞可引起心肌缺血、缺氧甚至坏死，故血流的早期恢复是挽救坏死心肌的唯一途径。但研究发现，心肌缺血再灌注往往会加重心肌损伤，即出现心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)[2]。MIRI指缺血缺氧的心肌组织恢复血液供应后，心脏结构的进一步破坏以及心肌细胞代谢功能障碍的进一步加重，甚至发生不可逆性损伤，主要包括梗死面积的再扩大和危及生命的心律失常。临床上采用传统治疗方法对缺血心肌的治疗效果欠佳，如溶栓治疗或经皮冠状动脉介入治疗[3]。目前，MIRI的发病机制尚未完全阐明，一般认为氧化损伤、炎症、钙超载、凋亡、自噬等是MIRI发生的重要原因，且各损伤机制间的联系和相互作用还可诱发更严重的损伤[4-5]。

多肽类药物由α-氨基酸以肽键连接而形成，也是蛋白质经过水解后形成的中间产物，其中寡肽由2～10个氨基酸组成，而多肽由10～50个氨基酸组成。多肽类药物具有活性高、疗效稳定、不良反应小、用量少等特点，在临床上得到广泛应用[6]。近年来，随着基因组学、蛋白组学和生物信息学研究的快速发展，多种有效技术(如组合化学、高通量筛查等)被用来筛选各种多肽，因此用于疾病诊断、治疗和预防的多肽类药物的种类和数量逐渐增多。目前，多肽类药物的研究开发已经延伸到疾病防治的多个领域，新型多肽类药物不断出现，对治疗MIRI、获得性免疫缺陷综合征、肝炎、糖尿病、恶性肿瘤和慢性疼痛的效果显著[7]。临床前研究中，已发现多种多肽类药物具有较理想的防治MIRI的效果[8]。现对多种抗MIRI多肽类药物予以综述，以期为多肽类药物抗MIRI作用及其机制的深入研究提供参考，并为其临床开发与应用提供新思路。

1 MIRI的临床表现

1.1再灌注性心律失常 再灌注性心律失常通常发生于再灌注的起始阶段，时间长短不一，可发生也可不发生。心律失常通常表现为期前收缩、自发性室性心律失常、室性心动过速、心室颤动等。MIRI一般发生在动物实验研究心肌再灌注后15 min左右，而临床患者冠状动脉溶栓治疗后，一般不出现严重的心律失常，可能是依次进行的溶栓治疗、再灌注和冠状动脉再通对心肌产生不同影响所致，故需注意MIRI动物模型的选择[9]。然而，心肌梗死急性期缺血引起的致死性室性心律失常(如室性心动过速、心室颤动等)常会导致患者猝死，即使及时接受再灌注治疗的急性心肌梗死患者仍有可能发生猝死。研究发现，再灌注性心律失常主要与缺血时间的长短、缺血的严重程度、再灌注血流情况、缺血心肌的数量或范围、电解质紊乱程度等因素密切相关，其发病机理可能包括MIRI期间的氧化损伤、钙超载以及心肌膜ATP依赖性钾通道开放等变化导致心肌细胞的兴奋性和传导性改变；MIRI期间引起的心肌细胞电解质紊乱、心室颤动阈值降低等导致的室性心律失常；MIRI期间大量儿茶酚胺释放导致心肌细胞自律性提高[10-11]。

1.2再灌注性心肌顿抑 心肌顿抑于1982年由Braunwald和Kloner[12]率先提出，指心肌发生缺血再灌注后，缺血所造成的心肌部分功能(结构、转运、代谢等)需要经过一段时间的自身调节才能恢复的状态，即缺血再灌注后的可逆性心肌损伤和亚致死性推迟恢复的过程。许多心脏病并发症的发生均与心肌顿抑状态有关，心肌顿抑对临床治疗效果的影响较大，并可阻碍疾病恢复。心肌顿抑的发生主要与钙超载、过氧化损伤、心肌灌注障碍、心肌细胞兴奋-收缩偶联异常、线粒体能量缺乏及功能障碍等因素有关，而钙超载和氧化损伤是心肌顿抑发生的主要机制[13]。

1.3心功能损伤 心功能损伤是MIRI的主要临床表现之一，其中心率、左心室收缩压、左心室内压最大上升速率以及左心室内压最大下降速率是评价心脏功能的重要参数[14]。心率是心功能改变的敏感指标；左心室收缩压和左心室内压最大上升速率可反映心肌的整体收缩功能，左心室收缩压或左心室内压最大上升速率降低表明左心室收缩功能下降；左心室内压最大下降速率反映左心室心肌的舒张功能，其降低则表明左心室舒张功能异常。由此可见，上述指标可很好地评价MIRI动物或患者的心功能，对评价新药的临床治疗效果有很好的启示作用。

2 MIRI的治疗原则

2.1MIRI的缺血预适应 缺血预适应指冠状动脉短暂、多次缺血后进行的心肌再灌注，可对心肌产生一定的保护作用，若心肌对长时间缺血的耐受性明显增强，可有效减轻MIRI。缺血预适应能够对心肌起到双相保护作用，一般在缺血预处理后几分钟迅速进入早期保护阶段，维持时间为2～3 h，主要通过激活缓激肽的快速信号和G蛋白偶联相关受体(如阿片受体、腺苷受体等)起作用；而迟发保护阶段一般发生在心肌缺血后12～24 h，持续时间为4 d，主要由内皮细胞抗氧化酶进行缺血保护，如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和热激蛋白70等[15]。目前，临床上已不应用缺血预适应的主要原因是：①心肌缺血前进行缺血预适应刺激，其保护作用的获得以心肌细胞缺血为代价，临床应用范围明显受限；②缺血预适应可引起动脉粥样硬化加重和冠状动脉破裂，对心脏功能也造成严重影响[16]。

2.2药理性预适应 药理性预适应指再灌注前使用各种有效活性物质进行缺血预处理，诱导缺血耐受的过程，即采用药物替代缺血刺激所产生的预适应。主要通过激活ATP敏感性K+通道、一氧化氮通道和N-甲基-D-天冬氨酸受体等保护心脏，临床应用范围较广[17]。目前，药理性预适应多应用于动物实验过程，可作为药物治疗前景的预判，为深入研究缺血预处理奠定基础。近年来，中西医对药理性预适应研究侧重点不一，西医研究的热点集中于受体、酶以及离子通道激动药等；而中医研究的热点集中于中药及其药效成分，如丹参、刺五加、黄芪、人参皂苷Rb1、川芎嗪等。在药理性预适应研究方面，多肽类药物对MIRI具有较好的缺血耐受性，其作用机制主要与改善细胞内钙超载、降低氧自由基的生成和减少炎症因子产生等有关[18-19]。

2.3缺血后适应 缺血后适应指心肌长时间缺血后，在再灌注开始时立刻反复进行多次缺血处理和短暂复流，随后进行持续性复流，增强心肌对缺血的耐受性过程。缺血后适应对心肌的保护强度不逊于缺血预适应，但真正的临床实施存在较大困难。缺血后适应的潜在保护机制是通过抑制细胞凋亡信号通路减少氧自由基产生，并可激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路，从而减轻炎症反应[20]。然而，各种信号通路之间也会互相影响，如降低氧自由基可抑制细胞凋亡信号通路，协同缺血后适应起到MIRI保护作用。当缺血后适应发挥作用后，激活蛋白激酶B信号通路，进一步激活mTOR，随后促进细胞增殖分化，并抑制炎症反应。

2.4药物后处理 药物后处理是对缺血后适应的深入研究，指长时间心肌缺血后，通过药物干预(于再灌注前或再灌注开始的前几分钟内用药)减轻MIRI的处理过程[21]。缺血后处理能较好地解决处理心肌缺血时机的问题，但仍无法避免心肌的创伤性损伤。随后，为了达到更好的MIRI保护作用，相关研究热点逐渐转移到药物后处理。药物后处理是一种外源性介入方式，其对心肌的潜在保护机制与缺血后处理非常相似，且较缺血后处理具有更多的优点，如具有较高的安全性、可控性、可预测性、操作简便性，临床应用价值很大。

3 多肽类药物及作用机制

3.1多肽类药物与氧化损伤 氧化损伤是指机体在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子[如活性氧类(reactive oxygen species，ROS)和活性氮]产生过多，氧化程度超出机体的抗氧化能力，引起氧化系统和抗氧化系统失衡，进而导致组织损伤。氧化损伤被认为是多种组织缺血再灌注损伤的重要致病机制，主要由ROS和活性氮等活性物质组成[22]。机体存在两类抗氧化系统，一类是酶抗氧化系统，包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等；另一类是非酶抗氧化系统，包括维生素C、维生素E、谷胱甘肽等。自由基含有不成对的电子，生物活性异常活跃，极易发生过氧化反应，包括氧自由基和烷自由基。受控的自由基可被用来杀灭细菌和寄生虫，还能参与清除毒素，保护机体免受伤害。若自由基数量过多并失去控制，当抗氧化物质不足时，自由基也可以伤害正常细胞。研究表明，氧化应激是MIRI发展的重要原因，反映了体内氧化剂与抗氧化剂的失衡，MIRI引起ROS大量生成，细胞脂质、蛋白和DNA等严重受损，最终导致细胞衰老和凋亡[23]。

半乳糖凝集素-3属于凝集素家族的成员，大约由130个氨基酸组成。结构中有3个独特的结构域：①一个包含甘氨酸、酪氨酸、脯氨酸的重复序列；②专门与含有n-乙酰乳糖胺的糖蛋白结合的结构域；③一个短NH2端包含一个丝氨酸磷酸化位点。半乳糖凝集素-3在体内多种细胞中均有表达，在小鼠MIRI模型中，半乳糖凝集素-3可显著升高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽和过氧化氢酶的活性，抑制自由基产生，从而改善MIRI[24]。pNaKtide是来源于钠钾ATP酶α1亚单位N端的多肽，研究表明，pNaKtide能够减弱钠钾ATP酶/Src/ROS信号通路的活性，抑制心肌细胞的氧化应激反应，从而起到心肌保护作用[25]。相关研究发现，鹿茸中分离纯化得到的鹿茸多肽(分子量约为6 500)能明显升高MIRI大鼠模型心肌组织中超氧化物歧化酶的活性，并降低血清丙二醛水平，从而改善MIRI[26]。

3.2多肽类药物与炎症 炎症在心脏功能的病理生理机制中起关键作用。炎症是具有血管结构的活体组织对损伤因子的防御反应，一般炎症反应是宿主防御损害和组织修复的积极过程，过度的炎症反应可产生大量的促炎症因子、细胞表面分子和趋化因子，最终引起组织发生严重的功能损害。炎症的调节机制较复杂，目前尚未完全阐明[27]。炎症通路中的模式识别受体可识别病原生物表面的病原体相关分子模式，并启动机体炎症，是机体固有免疫的重要组成部分。Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)是模式识别受体家族的重要成员之一。心肌缺血再灌注发生时，TLRs通过识别损伤相关的分子模式进一步激活下游信号通路，引发一系列的促炎症因子的释放，如肿瘤坏死因子-α、白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、IL-8，从而引起机体的炎症反应。TLRs不仅是先天性宿主防御的第一道屏障，还可调节机体的适应性免疫应答，其中TLR4在心脏表达最高，在MIRI的炎症过程中起关键作用[28]。

Roh等[29]发现了降钙素基因相关肽超家族新成员——中叶素，其由47个氨基酸组成，因其结构和功能与肾上腺素相似，又被称为ADM2。中叶素在人体分布广泛，在心脏、脑和肾脏均呈高表达，其药理作用比肾上腺素更强、更广泛，不仅具有舒张血管、降低血压等作用，还对MIRI和心力衰竭具有重要的保护作用。对糖尿病大鼠的研究发现，中叶素可明显降低血清及心肌组织中肿瘤坏死因子-α、IL-1β 和IL-6的水平，从而抑制心肌缺血再灌注后的多种炎症反应[30]。抑肽酶是一种碱性多肽，作为一种天然的小分子丝氨酸蛋白酶抑制剂，它可以抑制多种丝氨酸蛋白酶的释放。抑肽酶能有效地降低MIRI过程中血清IL-8和肿瘤坏死因子-α的水平，减轻心肌细胞的损伤程度并减少白细胞浸润，对缺血再灌注引起的心肌损伤具有保护作用，其机制可能与抑制白细胞活性及减少细胞因子合成和释放有关[31]。

3.3多肽类药物与细胞内钙超载 钙超载也是MIRI的重要发病机制之一。钙超载是各种原因引起的细胞钙平衡系统功能失调和钙分布紊乱，导致细胞内钙浓度异常升高或过度蓄积的现象，也称为钙超负荷。钙超载常引发心功能变化(如心室舒张不全)，严重者还会导致舒张性心力衰竭，可明显影响线粒体的氧化磷酸化功能，如激活钙依赖性磷脂酶和蛋白酶，影响ATP生成，致使细胞能量代谢发生障碍，最终导致细胞凋亡[32]。

血管紧张素1-7是由天冬氨酸、精氨酸、缬氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、组氨酸和脯氨酸所组成的多肽，分子量为899，属于肾素-血管紧张素系统的成员，具有扩张血管、抑制血管平滑肌细胞增殖等作用。有研究发现，血管紧张素1-7可明显减少MIRI大鼠心肌细胞舒张期细胞内钙浓度，提示血管紧张素1-7对心肌缺血再灌注的保护作用与其钙超载抑制作用密切相关[33]。谷胱甘肽是由谷氨酸、胱氨酸及甘氨酸组成的一种含有巯基的三肽，相对分子质量为307.33，具有抗氧化作用，并可参与肝脏的解毒作用。谷胱甘肽结合小分子氯离子通道蛋白巯基位点，引起蛋白结构改变，抑制离子通道开放，抑制钙诱导钙释放机制，改善钙超载，从而起到MIRI保护作用[34]。此外，谷胱甘肽也可减少钾通道开放，降低心肌细胞去极化活性，抑制胞质内钙超载的发生。

3.4多肽类药物与细胞凋亡 细胞凋亡是基因控制的细胞自主有序死亡，缺血、炎症、钙超载、氧自由基等均可诱导心肌细胞凋亡[35]。研究证实，MIRI会伴随心肌细胞凋亡，特别是持续性缺血期和缺血再灌注期可见到大量的心肌细胞凋亡[36]。心肌细胞凋亡调控机制分为细胞外途径和细胞内途径两种，且两种途径相互作用。多种炎症因子参与细胞外凋亡途径，首先炎症因子与相应的胞外受体结合，诱导相关蛋白的聚集，分别激活凋亡蛋白激酶胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶8，启动细胞凋亡。氧化应激参与内源性凋亡途径，过量ROS可激活B淋巴细胞瘤-2，促进促凋亡蛋白Bax的生成，与相应受体结合后增加线粒体膜的通透性，进而诱导多种促凋亡蛋白的释放，如细胞色素C、核酸内切酶G，激活胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9的释放，从而启动细胞凋亡。

次血红素六肽是根据抗坏血酸过氧化物酶的主体结构、微过氧化物酶-9的结构，以亚血红素为靶分子筛选噬菌体展示肽库所得到的序列，设计合成的含组氨酸的过氧化物酶模拟酶。研究发现，次血红素六肽可明显降低MIRI大鼠心肌细胞的凋亡率，上调MIRI大鼠心肌组织抗凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2的表达量，升高B淋巴细胞瘤-2/Bax比率，下调胱天蛋白酶3的表达量[37]。

3.5多肽类药物与自噬 自噬是真核细胞的一种防御和应激调控机制，衰老细胞、受损细胞器和过度蓄积或错误折叠的蛋白质主要通过细胞自噬途径进行消除和再利用，维持细胞内环境相对稳定，是细胞内广泛存在的正常生理过程和防御体系[38]。自噬过程包括分隔膜的形成、自噬体的形成、自噬溶酶体的形成和内容物的降解，自噬通过一系列保守的自噬相关基因(autophagy-related genes，ATG) 进行调控。心肌细胞缺血早期可引起能量代谢障碍，导致ATP/AMP比值下降，激活LKB1-AMP活化的蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)信号通路，即LKB1激活信号分子AMPK，AMPK激活TSC1/2复合体，进而抑制mTOR的活性，从而诱导ATG1、ATG1与ATG11、ATG1与ATG13、ATG1与ATG17复合物的形成，进一步启动自噬并形成自噬体。在心肌细胞缺血期，自噬对心肌细胞的存活产生积极作用，如降解细胞内衰老及功能不全的细胞器和蛋白质，自噬降解后可释放出氨基酸和脂肪酸，并通过三羧酸循环产生ATP，补偿心脏缺血的能量危机；在心肌再灌注期，自噬仍处于激活状态，但诱导自噬的途径与心肌缺血阶段不同，再灌注后，心肌细胞再次得到充足氧供，在缺血阶段通过LKB1-AMPK信号通路诱导的自噬途径被抑制，而Beclin-1在再灌注期的自噬过程中发挥主要作用。Beclin-1的过表达可明显增加再灌注期间的自噬活性，但目前具体的机制还未完全阐明[39]。

促红细胞生成素衍生肽又称螺旋B表面肽，是在促红细胞生成素结构基础上衍生出的多肽。螺旋B表面肽既保留了促红细胞生成素的组织保护活性，又无促红细胞生成素的不良反应，如不导致血栓形成及高血压。螺旋B表面肽能显著抑制细胞自噬，减轻小鼠MIRI，其保护机制可能与激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/mTOR转导通路相关[40]。mTOR是关键的细胞自噬调节因素之一，许多信号转导通路都交集于mTOR。在机体营养丰富或有生长因子存在情况下，mTOR成为关闭细胞自噬的主要抑制性信号。细胞处于低能量状态下，上游信号通路LKB/AMPK抑制mTOR磷酸化，促使自噬，进而产生更多的能量[40]。

4 小 结

多肽类药物作为重要的生物医药种类，具有适应证广、安全性高且疗效显著等优点，具有广阔的临床应用前景，对MIRI的治疗效果较理想，其具体作用机制涉及氧化损伤、炎症、钙超载和自噬等。目前，对MIRI具有改善作用的多肽主要有半乳糖凝集素-3、降钙素基因相关肽、血管紧张素1-7、次血红素六肽和促红细胞生成素衍生肽等。随着相关基础研究以及临床研究的不断深入，越来越多高效低毒的多肽类药物将不断地涌现，将对MIRI的防治发挥更大的作用。