池鹭消化道线虫cox1基因序列分析与虫体鉴定

李 朝 普丽花 李维芬 杨建发 邹丰才 黄翠琴

(1.云南农业大学动物医学院，昆明，650201；2.昆明市濒危动植物收容拯救中心，昆明，651700；3.龙岩学院生命科学学院，福建省家畜传染病防治与生物技术重点实验室，龙岩，364000)

池鹭(Ardeolabacchus)，又名红毛鹭、红头鹭鸶、沙鹭、花窖子、开乌、田螺鹭、沼鹭(台湾)等，属于鹭科(Ardeidae)池鹭属[1]。我国鹭科鸟类共有9属20种18个亚种[2-3]。池鹭在水中趟水行走觅食，主要以动物性食物为主，如小鱼、虾、蛙、螺、泥鳅、水生昆虫、蝗虫等，兼食少量植物性食物。池鹭已被列入《国家保护的有益的或者有重要经济、科学研究价值的陆生野生动物名录》，被列入《世界自然保护联盟》(IUCN)2008年鸟类红色名录-ver3.1—低危(LC)[4]。

线粒体DNA(mtDNA)是真核细胞的核外环状遗传物质，它具有分子量小、结构简单、进化速度快、母性遗传等特点，是国内外的专家学者研究寄生虫分子分类、群体遗传、系统进化的一种长期广泛运用分子标记[5-9]。相对保守的线粒体细胞色素C氧化酶1(cytochromeCoxidase 1，cox1)基因片段被广泛运用于种群遗传学的研究[10-14]。

本研究解剖死亡池鹭检查，在消化道获取成虫虫体，采集粪便饱和食盐水漂浮法检查虫卵，采用形态学观察和分子生物学鉴定综合分析，该研究结果可为珍稀野生鸟类蛔虫等寄生虫的分类、鉴定和遗传变异研究提供参考，为进一步防治蛔虫病奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源

昆明市林业局濒危动植物收容拯救保护中心送检死亡的池鹭，解剖后在胃肠道发现线虫(Nematoda)，经取其粪便镜检和形态学观察后发现此线虫疑似蛔虫(Ascarididae)。将线虫保存于75%酒精中备用。

1.1.2 主要试剂

DL2000 DNA Marker 购于TaKaRa试剂公司、Mix酶购于上海生物工程(上海)股份有限公司、无水乙醇、琼脂糖粉、1×TAE缓冲液、ddH2O、血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒购自天根生物科技有限公司。

1.1.3 实验设备

主要仪器有电子显微镜、电子天平、离心机、漩涡振荡器、微波炉、恒温水浴锅、PCR仪、电泳仪、Eppendorf移液枪、凝胶成像系统、海尔冰箱、超净工作台、常用玻璃器材、手术刀、手术剪等。

1.2 方法

1.2.1 临床解剖

将2只池鹭解剖，暴露胸腔后观察内脏器官有无病理变化，观察池鹭的消化道有无寄生虫感染。

1.2.2 形态学观察

消化虫体肉眼观察和虫卵显微镜观察。取大约2 g左右的粪便置于一个小烧杯中，先在烧杯中加入少量饱和食盐水，用玻璃棒将粪便搅拌调匀，然后向烧杯中加入约为粪便的10倍量左右的饱和食盐水，并用玻璃棒搅拌均匀，用40目的铜丝筛将粪样过滤到青霉素小瓶内，在瓶口轻轻盖一个载玻片，不能产生气泡，每组做3份平行，滤液静置约15～20 min，此时比饱和食盐水比重轻的虫卵大多浮于液体表面，然后将载玻片提起进行镜检。

1.2.3 PCR扩增

取5条虫体，各虫体分别取一小片段，命名为XC1、XC2、XC3、XC4、XC5，将剪好的虫体放置在1.5 mL的离心管内剪碎，分别加入200 μL缓冲液GA与20 μL蛋白酶K，然后将样品置于56℃的水浴锅里消化过夜。按DNA提取试剂盒里的使用说明书提取虫体基因组总DNA，然后将其保存在-20℃下。

参考Gasser等[14]文献报道的引物扩增此线虫的cox1基因。预期扩增的目的片段的大小约450 bp，上游引物JB3：5′-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3′(24 bp)，下游引物JB4.5：5′-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3′(24 bp)。引物合成于上海生物工程股份有限公司。反应扩增体系在25 μL下进行：Mix酶为12.5 μL，上游引物和下游引物各0.5 μL，超纯水10.0 μL，模板DNA为1.5 μL。反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，45℃退火45 s，72℃延伸30 s，共进行35次循环；最后72℃延伸5 min，16℃反应结束。同时设阳性和阴性对照。取4 μL PCR产物于1.5%的琼脂糖凝胶电泳仪上检测，检测结果可通过紫外透射仪拍照记录。

1.2.4cox1基因部分序列测定及其进化分析

PCR阳性产物送测序公司进行双向测序，测序结果SeqMan5.01拼接，NCBI-Blast在线比对，根据NCBI-GeneBank公布的蛔虫相关序列，在NCBI在线构建遗传系统进化树(Distance tree of results)，采用的构建方法为相邻法(Neighbor joining method)。

2 结果

2.1 临床解剖

将已经死亡的2只池鹭解剖，主要的脏器无明显肉眼可见病变。解剖后在其中1只池鹭的胃肠道内发现线虫，疑似蛔虫(图1～2)。

图1 送检死亡池鹭Fig.1 Submitted the dead pond heron

图2 蛔虫严重阻塞小肠Fig.2 The nematode seriously obstruct the small intestine

2.2 形态学观察

从消化道中分离出约12条蛔虫，其中雄虫4条，雌虫8条。雄虫长3.5～7 cm；雌虫长3.0～10.0 cm，尾直而尖细。虫卵近似圆形或椭圆形，卵壳多为光滑，相对较厚。虫卵外壳呈现淡黄色，内容物近似灰褐色。

图3 蛔虫形态学观察Fig.3 Morphological observation of nematode

2.3 PCR扩增结果

将PCR产物于1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，我们可以从电泳图见约443 bp的条带(图4)，与预期的目的片段的大小相符，有特异性条带出现。

2.4 pcox1基因部分序列测定及其进化分析

测序结果显示，池鹭消化道线虫的分离株的cox1序列长度一致，为443 bp，序列中A、G、T、C、碱基的平均含量分别为17.16%、25.06%、46.28%、11.51%，A+T的含量(63.43%)明显高于C+G含量(36.57%)。在NCBI在线构建遗传系统进化树(Distance tree of results)，采用的构建方法为相邻法(Neighbor joining method)。结果显示，与基因库中的狮弓首蛔虫(Toxascarisleonina)所属分支位于同一大分支，而与其他蛔虫所属分支相距较远。表明从池鹭肠道采集到的蛔虫同为狮弓首蛔虫，并且种内差异明显低于种间差异，证明线粒体cox1 基因可以作为种间分子标记用于狮弓首蛔虫的分子鉴定。

图4 池鹭消化道线虫pcox1 mtDNA的PCR扩增产物Fig.4 PCR amplication of nematode mtDNA cox1 from the digestive tract of Ardeola bacchusM：DNA 分子质量标准；1～5：XC1、XC2、CX3、CX4、CX5-：阴性对照；+：阳性对照M：DL2000DNA Marke；1～5：XC1、XC2、CX3、CX4、CX5-：Negative control；+：Positive control

图5 cox1 基因片段进化树分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of cox1 gene fragments

3 讨论

池鹭是一种迁徙鸟，途经地区较多且活动范围较广泛，通常喜欢在稻田、池塘、湖泊、水库和沼泽湿地等水域嬉戏采食，增加感染寄生虫的风险。池鹭等生活于湿地沼泽，可能会啄食到水中感染携带寄生虫鱼虾等中间宿主，成为感染传播寄生虫的重要终末宿主。国内针对鹭科(Ardeidae)等水鸟感染寄生虫的报道研究较少，卢建红等[15]报道白鹭(Egrettagarzetta)住白细胞虫病的诊断与综合防制。国外学者关于鹭科类的寄生虫有少量报道，例如血液原虫和弓形虫(Toxoplasmagondii)[16-18]。国外学者主要研究鹭科水鸟、水生鱼虾以及寄生虫的传播模型、相互作用和遗传变异等[19-24]。

蛔虫病是对野生动物危害较为普遍和严重的一种寄生虫病。蛔虫广泛寄生于野生动物体内，造成生长缓慢、腹痛腹泻，甚至肠道阻塞等[25]。弓首蛔虫广泛感染寄生与人和宠物，包括犬、猫等[26-31]。无脊椎动物、鸟类和一些小型哺乳类动物，在弓首蛔虫卵的散布方面起着重要的作用。鸟类(如鸽Columbalivia、八哥Acridotherescristatellus、麻雀Passermontanus等)通过爪或喙把虫卵从一个地方携带到其他地方，它们都是把虫卵从污染地散布到远处的重要媒介[32-33]，另一种虫卵散布的机制是通过水体[34]。

动物园、濒危动植物收容拯救中心、动物保护基地等相关机构，对于鸟类的蛔虫感染，可以用丙硫咪唑、甲苯咪唑，左旋咪唑、枸橼酸哌嗪和伊维菌素等药物进行治疗，用药剂量根据动物体型略有加减，通过饮水、饲料等给药[35]。加大研制适用于野生鸟类的新型复方驱虫药力度，为野生鸟类的保护提供有力保障。采取“预防为主，治疗为辅”的防治方针，定期采集粪便进行寄生虫检测。同时，宣传教育游客文明参观，不乱投食物，降低感染风险，共同保护动物健康。