酱香型白酒酒醅酶活性和轮次酒理化指标分析

戴奕杰，李宗军*，田志强

（1.湖南农业大学 食品科技学院，湖南 长沙410128；2.贵州省产品质量监督检验院，贵州 贵阳550016）

随着对中国白酒不断的深入研究，微生物及其酶系的作用关系被认为是不同香型白酒风味特征形成的重要因素。酱香型白酒独特的酿造工艺形成了其特殊的微生物区系，这些微生物产酶及代谢活动相互作用，最终形成了白酒特殊风味物质。因此，将微生物与其产酶种类及含量结合，是目前研究白酒的风味、酒质和产酒率的主流方向[1]。蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、果胶酶、单宁酶、脂肪酶等构成酱香型白酒的水解酶系[2-4]。一般而言，淀粉酶和蛋白酶主要是由细菌和霉菌产生，而糖化酶主要是由霉菌产生[5-8]。现阶段，研究者们倾向于将产酶量高的菌株应用于强化大曲的制备[9]。

酱香型白酒的理化指标是鉴定轮次酒是否发酵成熟的标准，反映着酱酒的品质高低。张健等[10-11]研究发现，理化指标中总酸与白酒香气强度和协调性呈强正相关，化学指标（总酸、总酯）对白酒的香气品质的影响比较大，物理指标（白利糖度、电导率和黏度）影响很小。堆积过程中，网罗的微生物不断繁殖代谢，使糟醅品温不断升高，与此同时，各轮次的物质成分逐渐被消耗使其轮次酒的酯、酸、酒精度、固形物等理化指标也在不断变化。轮次酒由于酿造条件的不同而风格质量各异。

本研究从下沙阶段开始到七轮堆积发酵结束，分别在起窖和下窖阶段采集酒醅样本，检测其酶活性，并记录在此期间七轮次酒的酒精度、总酸、总酯等理化指标。探究微生物多样性、酶系、理化性质之间的关系是如何影响酱香型白酒酒质的，对白酒酿造机理的阐明和酿造工艺的改进具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 酒醅的采集

按照传统酱酒的酿造工艺，在贵州某酒厂酿造过程中进行采样。选取整个酱香白酒发酵工艺的下沙、糙沙和七轮次发酵过程的高温堆积、窖池发酵工序的糟醅，取样方法：对高温堆积和窖池发酵酒醅的上、中、下层进行取样，各层面进行3个重复，共9个抽样点。将上述采样位点的样品破碎并混匀后，分装于无菌袋封装标记，冷冻保存。样本信息如表1所示。

表1 酒醅样本采集信息Table 1 Information of fermented grains sample

1.1.2 轮次酒的采集选取上述发酵过程所产的轮次酒进行采样，对七个轮次酒熟糟上甑蒸酒取酒，每瓶500 mL的容量。编号为6、9、12、15、18、21、24的样本依次对应为第1～7轮次的熟糟上甑蒸酒取酒。

1.1.3 试剂

糖化酶检测试剂盒：上海双赢生物科技公司；α-淀粉酶检测试剂盒：西班牙博士泰公司；纤维素酶检测试剂盒：西宝生物科技（上海）股份有限公司；蛋白酶检测试剂盒：上海抚生实业有限公司；酯化酶检测试剂盒：上海酶联生物科技有限公司；果胶酶检测试剂盒：合肥莱尔生物科技有限公司；单宁酶检测试剂盒：上海纪宁实业有限公司；脂肪酶检测试剂盒：上海通蔚科技有限公司。

1.2 仪器与设备

BP211D电子分析天平：北京赛多利斯公司；LC-20AD高效液相色谱仪：日本岛津公司；pHS-3C精密pH计：上海雷磁仪器厂；Epoch酶标仪：美国Biotek公司；DZKW-S-6电热恒温水浴锅、202型电热恒温干燥箱：北京市永明医疗仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酒醅中酶系测定方法（1）样本的前处理

准确称取酒醅样本各10g，放入装有无菌搅拌珠的90mL生理盐水中，60 ℃恒温水浴锅中水浴1 h，期间不停搅拌，用滤纸过滤后得到过滤液，用于酶活性分析测定。

（2）酶活性的测定

应用双抗体夹心法（酶联免疫分析）测定样本中的8种酶的酶活水平。

用纯化的酶抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入酶，再与辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的酶抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物四甲基联苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的酶浓度呈正相关。用酶标仪在波长450 nm处测定吸光度（OD450nm值），通过标准曲线计算样品中酶活性，以U/g醅以及mIU/g醅计（后文分别以U/g和mIU/g表示）。1.3.2 轮次酒的理化指标测定方法

轮次酒的酒精度、总酸、总酯、固形物的含量测定参照国标方法GB/T 10345—2007《白酒分析方法》测定，采用气相色谱内标法进行分析，各指标要求如表2所示。

表2 轮次酒理化指标要求Table 2 Physical and chemical indexes requirements of each round Baijiu

2 结果与分析

2.1 酱香型白酒酿造中酶活性变化规律

酱香白酒生产过程中各主要酶活测定结果见表3，其变化规律见图1～图8。

从大处说，如何改进和消除产品的“非功能性缺陷”，是供给侧改革的一个重要领域；从小处讲，如何将产品和服务的细节提升，是质量经济、创新经济的必答题。

表3 酱香白酒生产过程中各主要酶活Table 3 Main enzyme activities in the production of sauce-flavor Baijiu

（1）发酵过程中脂肪酶活性的变化

由图1可知，整个发酵进程中脂肪酶活力呈现阶梯性缓慢下降的趋势，从下沙堆积时最高值（82.75 U/g）下降到第7轮次起窖时最低值（55.69 U/g），中途在三轮次下窖时达到76.26 U/g，仅次于下沙堆积。脂肪酶是一种特殊的酯键水解酶，它可作用于甘油三酯的酯键，使甘油三酯降解为甘油二酯、单甘油酯、甘油和脂肪酸[12]。酱香酒生产过程中脂肪酶可以作用于微生物的代谢产物，生成酒体风味物质的前体，后经过多重复杂的生化反应进而转化为酱香呈香物质。

图1 脂肪酶活性随发酵过程的变化Fig. 1 Changes of lipase activity with fermentation process

（2）发酵过程中酯化酶活性的变化

由图2可知，酯化酶活力在整个酿造工序中处于较为平稳的变化趋势，其中在二轮次下窖时达到最高值（790mIU/g），后均维持较高的数值并伴有小幅下降，直降到五轮次起窖时的713 mIU/g；酯化酶活力最低值在两个时间段出现，一个是二轮次起窖时（508 mIU/g），一个是七轮次起窖时（506 mIU/g）。酯化酶可直接将酸与醇催化合成酯类，包括同时合成中国白酒中重要物质己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯等酯类。酯类物质是酱香白酒中所检出化合物组分中种类最为丰富的一种，所以酯化酶在酱香白酒酿造过程中起着极其重要的作用。由图亦可以看出，在烤酒质量最佳的第3、4、5轮次酒醅中的酯化酶活力均较高，这也在一定程度上体现出了酯化酶所起到的重要作用。

图2 酯化酶活性随发酵过程的变化Fig. 2 Changes of esterase activity with fermentation process

（3）发酵过程中果胶酶活性的变化

由图3可知，果胶酶在整个酱香酒酿造工序中活性变化忽高忽低，无明显规律性。最高值（94.45 U/g）出现在二轮次起窖时，最低值（41.81 U/g）出现在七轮次起窖时。酿造过程中霉菌为主要功能微生物，而果胶酶产生菌株主要为曲霉，所以推测酱酒酒醅中果胶酶是由其中丰富的霉菌代谢产生的。果胶酶主要可以作用于酿酒原料中的果胶物质，最终生成半乳糖醛酸，该物质可作为多种微生物的碳源，进入反应体系被转化为酒体中的呈味组分[13]。（4）发酵过程中蛋白酶活性的变化

图3 果胶酶活性随发酵过程的变化Fig. 3 Changes of pectinase activity with fermentation process

由图4可知，蛋白酶活力随酿造工序进程呈现先上升后下降的趋势。下沙堆积初始蛋白酶活力为51.30 U/g，随后缓慢上升，至三轮次下窖时达到最高值（79.40 U/g），后迅速下降至七轮次起窖时达到最低值（33.80 U/g）。蛋白酶在酱香白酒酿造过程中起着关键性作用，其可以催化原料中的蛋白质及多肽水解，游离出多种氨基酸，而氨基酸可以进一步参与到反应体系中生成酸类、酯类、醛酮类、吡嗪类等化合物，所以其是重要的酱香前体物质[14-15]。酿造过程中细菌、酵母、霉菌均可以分泌出蛋白酶，保证了蛋白酶的来源及活性。

图4 蛋白酶活性随发酵过程的变化Fig. 4 Changes of protease activity with fermentation process

由图5可知，单宁酶活力在整个酿造工序中大体上呈现先上升后下降的趋势，期间忽高忽低，最高值出现在二轮次下窖时，为824 U/g，最低值为七轮次起窖时，为344 U/g。单宁酶主要为霉菌和酵母分泌产生，可降解原料中的单宁物质和蛋白质[16]，一方面可以降低酒体涩味感，一方面还可以生成多种中间代谢产物进入到后续反应中，为酱香风味的形成提供物质基础。（6）发酵过程中纤维素酶活性的变化

图5 单宁酶活性随发酵过程的变化Fig. 5 Changes of tannase activity with fermentation process

由图6可知，纤维素酶活力自下沙堆积开始整体处于上升趋势，直至五轮次起窖时达到最高值（1 806.50 mIU/g），后迅速下降至六轮次起窖时的1 055.90 mIU/g，后有所回升。纤维素酶活力在3～5轮次糟醅中均处于较高值。纤维素酶可由细菌和真菌分泌产生，以木霉、曲霉、青霉产量最为丰富，所以具有丰富霉菌体系的糟醅中纤维素酶活力旺盛[17-19]。纤维素酶可以降解酿酒原料中的纤维素成分而生成葡萄糖，一方面提高了原料的利用率，一方面也为微生物发酵提供基质。

图6 纤维素酶活性随发酵过程的变化Fig. 6 Changes of cellulose activity with fermentation process

（7）发酵过程中糖化酶活性的变化

由图7可知，糖化酶活力在整个酿造工序中均处于较高的水平，总体呈现先上升后下降的趋势，在二轮次起窖时达到最高值（2 020 mIU/g），后缓慢下降，直降至七轮次起窖时的1 365 mIU/g，在中间轮次（3～5轮次）时虽没有达到最高值，但是总体较为平稳。酿酒原料中小麦、高粱均具有高含量的淀粉，糖化酶能直接作用于淀粉或是其他多糖，将其转化为葡萄糖，是酿造过程中重要的酶类[20-21]。糖化酶的分泌主要是酵母和霉菌代谢产生，酱香酒醅中丰富的微生物区系为保证糖化酶活力提供了前提基础。

图7 糖化酶活性随发酵过程的变化Fig. 7 Changes of glucoamylase activity with fermentation process

（8）发酵过程中α-淀粉酶活性的变化

由图8可知，α-淀粉酶活性由下沙堆积时的417.65 U/g缓慢上升，一轮次下窖时达到第一个阶段高点（555.70 U/g），后缓慢下降又上升至三轮次下窖时的590.70 U/g，整体上下浮动的趋势不是很显著，这为发酵进程提供了较为平稳的淀粉酶活性。淀粉酶主要是将淀粉链切断成为短链糊精、寡糖、少量麦芽糖和葡萄糖，使淀粉黏度迅速下降达到液化目的，降低了原料的粘韧度，为后续的微生物利用原料起到促进作用，加速发酵进程[22]。

图8 α-淀粉酶活性随发酵过程的变化Fig. 8 Changes of α-amylase activity with fermentation process

2.2 理化指标及酒质鉴定

由表4可知，七个轮次的新酒中检测出酒精度、总酸、总酯及固形物的含量，酒精度、总酯和固形物指标随轮次的增加而逐渐降低，含量最低的为七轮次酒。总酸则呈现忽高忽低的变化。对照《仁怀大曲酱香酒技术标准体系》[23]的标准，七轮次酒的各项目含量均符合“一级”指标要求。其中，第三、第四、第五轮次酒无论是总酸还是总酯的含量均达到“优级”标准。第一、第二、第六轮次酒则总酸含量为“一级”，而总酯含量为“优级”。整体指标结果显示，优质酒呈现于中间轮次（3～5）中。

表4 轮次酒理化指标检测结果Table 4 Determination results of physical and chemical indexes of rounds Baijiu

3 结论

结果表明，糖化酶活性整体呈现先上升后下降趋势，且前期在窖池发酵阶段酶活增强，在堆积发酵阶段酶活性减弱，后期的轮次则相反。果胶酶酶活性表现为各轮次样本堆积下窖时高于窖池发酵起窖，推测果胶酶活性与堆积有一定的联系。因此，研究酱香型白酒酶系和微生物产酶关系为优化制曲工艺和制备强化大曲提供了理论依据。

白酒的理化成分分析结果表明，总酸在各轮次酒中呈现上下浮动，先下降后上升再下降；酒精度、总酯和固形物指标随轮次的增加而逐渐降低并趋向稳定，可能与各种中间物质在微生物及酶的作用下产生及消耗有关。其中，第三、第四、第五轮次酒的酒质最优，结合酶活性变化，初步揭示了酱香型白酒的质量高低与酿酒微生物菌群有关。目前白酒的风味研究大量集中在主要特征风味的探索，明显忽略了此部分的研究，应当在特征风味探寻的同时，从整体上评价各风味物质的贡献度。