脑脊液和海马组织儿茶酚胺氧位甲基转移酶与阿尔茨海默病模型大鼠学习记忆功能的相关性研究

陈 坤,卜淑芳,刘喜灿

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)多见于老年人，俗称老年性痴呆,其主要临床症状为认知障碍和记忆能力损伤等，是一种中枢神经系统退行性变性疾病[1]。随着人口老龄化的加剧，阿尔茨海默病严重危害了老年人的生命健康，患病率随着年龄的增加而升高[2]，目前全世界阿尔茨海默病患者已超过2400万人。由于阿尔茨海默病的病因复杂，当前的治疗手段效果并不理想。儿茶酚胺氧位甲基转移酶(catechol O-methyl-transferase，COMT)是一种参与儿茶酚雌激素代谢反应的关键酶，对雌激素导致的DNA损伤具有保护作用[3]。研究发现，儿茶酚胺氧位甲基转移酶可编码两条不同的mRNAs：可溶性的COMT(S-COMT)和膜结合型COMT(MB-COMT)[4]。研究证实，COMT在肿瘤组织中高表达，如结直肠癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌和子宫内膜癌等[5]。COMT作为一种参与儿茶酚胺类神经递质灭活的主要降解酶，与去肾上腺素和多巴胺的代谢密切相关[6]。因此，研究COMT 酶学活性对神经性疾病的治疗具有重要意义。因此，本研究通过脑立体定位仪向SD大鼠海马CA1区注射Aβ25-35，建立阿尔茨海默病大鼠模型，探究脑脊液和海马组织儿茶酚胺氧位甲基转移酶与阿尔茨海默病模型大鼠学习记忆功能的相关性。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂 实验动物：健康雄性SD老年大鼠(18～20个月)40只，体重为400～600 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。生长温度为(23±2)℃，环境湿度为45%～50%，光照时间为每天12 h，自由进食、进水，适应性饲养1 w。主要试剂：BCA 蛋白浓度测定试剂盒及ECL发光试剂盒购自碧云天生物技术研究所；COMT抗体和β-actin抗体均购自Abcom公司；其余为国产分析纯试剂。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组及给药 选取40只健康雄性SD老年大鼠(18～20个月龄)，随机分为假手术(Sham)组和阿尔茨海默病模型(Model)组，每组20只。经脑立体定位仪向SD大鼠海马CA1区注射Aβ25-35，建立阿尔茨海默病大鼠模型。模型建立具体操作步骤：将SD大鼠进行腹腔麻醉后，固定在脑立体定位仪上。根据《大鼠脑立体定位图谱》，确定大鼠脑部海马CA1区位置，并在两侧海马区各注射1 μl的Aβ25-35，假手术组注射等量的生理盐水。注射结束后，对大鼠脑部进行缝合。

1.2.2 行为学观察 本实验采用电刺激逃避即跳台法对大鼠的行为学进行观察。大鼠的学习记忆功能的观察指标为实验过程中各个大鼠出现的错误反应次数和潜伏期。(1)实验装置：跳台装置为 120 cm×80 cm×24 cm 的有机玻璃箱，刺激电极为箱底铺的铜栅。将箱子平均分为5格，大鼠回避电击的安全台为每格内分别放置的高8.5 cm，直径10.5 cm 的橡胶垫;(2)实验过程：将大鼠放入试验箱内适应5 min，以36 V交流电对鼠进行电击。大鼠在遭电击后逃上橡胶垫，再从橡胶垫上跳下，以双足接触铜栅遭到电击为错误反应次数一次。首先，对大鼠进行3 min的训练，并记录错误反应次数。24 h后再进行测验。实验方法同上，以大鼠首次从橡胶垫跳下时开始计时，作为大鼠触电潜伏期，并以大鼠第一次和第二次测试过程中出现的错误次数作为学习记忆功能的观察指标。

1.2.3 qPCR法检测各组大鼠脑脊液和海马组织中COMT的基因表达 实验结束后，对各组大鼠进行断头处死，并分离出脑部脑脊液和海马组织。采用组织匀浆机分别对脑脊液和海马组织进行充分研磨。采用Trizol提取法提取血管中的总RNA，按照Micro RNA 反转录试剂盒说明书对总RNA进行反转录。反转录体系为20 μl：1 μl总RNA，4 μl 5×Reaction Mix，2 μl 10×Super Script Enzyme Mix，加入双蒸水将体系补足至20 μl，混匀后离心。反应条件为：37 ℃下60 min，95 ℃下5 min，置于4 ℃保存备用。按照q-PCR试剂盒说明书进行转录扩增，反应体系为20 μl。使用SYBR Green染料法进行测定，每个样本设置4个复孔。按照试剂盒说明书的反应条件进行扩增。基因的相对表达量用2-△△CT法进行计算。

1.2.4 Western blot法检测各组大鼠脑脊液和海马组织中COMT的蛋白表达 各组大鼠在实验结束后进行断头处死，迅速分离出大鼠大脑脑脊液和海马组织，并保存于-80℃备用。提取组织蛋白，采用Western blot检测脑脊液和海马组织中COMT的蛋白表达水平。分别将大鼠的脑脊液和大脑海马组织置于研钵中，加入一定体积的蛋白裂解液对组织进行充分研磨，于冰上裂解30 min后，在4 ℃下、12 000×g离心10 min，吸取上清液，并使用BCA蛋白浓度试剂盒对其进行蛋白定量。选取5%的浓缩胶和10%的分离胶，取20 μl蛋白样品进行上样，电泳结束后，将蛋白转移至PVDF膜上。使用10%的脱脂乳粉溶液进行封闭2 h后，一抗(1∶1000)4 ℃孵育过夜。使用TBST洗膜3次，每次15 min，二抗(1∶4000)室温孵育2 h，用TBST洗膜3次。使用化学发光法对蛋白进行显色。

2 结 果

2.1 阿尔茨海默病对大鼠的逃避行为潜伏期影响 与假手术组比较，阿尔茨海默病模型组大鼠的潜伏期明显缩短(P<0.01)，说明阿尔茨海默病对大鼠的逃避行为潜伏期有着消极的影响(见表1)。

2.2 阿尔茨海默病对大鼠的学习记忆错误次数影响 阿尔茨海默病模型组大鼠错误(4.87±1.87)次显著增加(P<0.01)，说明阿尔茨海默病严重损害了大鼠的学习记忆功能(见表1)。

2.3 各组大鼠脑脊液中COMT的mRNA表达情况 实时定量PCR(q-PCR)测定结果显示，与假手术组相比，阿尔茨海默病模型组大鼠脑脊液中COMT的mRNA表达量均显著升高(P<0.01)，说明阿尔茨海默病可提高大鼠脑脊液中COMT的mRNA表达量(见表1)。

2.4 各组大鼠海马组织中COMT的mRNA表达情况 实时定量PCR(q-PCR)测定结果显示，与假手术组相比，阿尔茨海默病模型组大鼠海马组织中COMT的mRNA表达量均显著升高(P<0.01)，说明阿尔茨海默病可提高大鼠海马组织中COMT的mRNA表达量(见表1)。

2.5 各组大鼠脑脊液中COMT的蛋白表达情况 Western blot测定结果显示，与假手术组相比，阿尔茨海默病模型组大鼠脑脊液中COMT的蛋白表达量显著上调(P<0.01)，说明阿尔茨海默病可上调大鼠脑脊液中COMT的蛋白表达量，这与mRNA的表达结果相一致(见表1、图1)。

2.6 各组大鼠海马组织中COMT的蛋白表达情况 Western blot测定结果显示，与假手术组相比，阿尔茨海默病模型组大鼠海马组织中COMT的蛋白表达量显著上调(P<0.01)，说明阿尔茨海默病可上调大鼠海马组织中COMT的蛋白表达量，这与mRNA的表达结果相一致(见表1、图2)。

表1 Model组和Sham 组大鼠的各项指标比较

图1 各组大鼠脑脊液中COMT的蛋白表达情况

图2 各组大鼠海马组织中COMT的蛋白表达情况

3 讨 论

阿尔茨海默病是一种原发性的退行性脑部疾病，其发病机制尚不明确，推测可能与基因突变、家族遗传、神经递质及生化改变、免疫功能紊乱、神经生长营养因子缺失、铝中毒、能量代谢降低以及激素水平下降等因素有关[7]。当前的学者们提出了多种关于阿尔茨海默病的发病机制学说，包括胆碱能缺陷学说、β淀粉样蛋白级联学说、tau蛋白异常磷酸化学和氧化应激学说等[8]。临床上治疗阿尔茨海默病的药物主要有抗氧化剂、胆碱酯酶抑制剂、神经营养因子、抗炎药物和兴奋性氨基酸等，但疗效并不理想[9]。因此，探究阿尔茨海默病的发病机制，对其治疗具有重要的意义。在阿尔茨海默病的发病早期，Aβ 沉积是发病的主要临床表现和病理变化[10]。研究发现，大鼠海马区的Aβ 沉积可对突触传递和LTP造成破坏，并损伤大鼠的学习记忆功能[11]。Aβ生成过多和Aβ清除障碍是导致Aβ在AD患者脑内大量沉积的主要原因。研究证实，在小鼠脑内注射Aβ，可导致脑内海马神经元大量凋亡[12]。因此，本研究经脑立体定位仪向SD大鼠海马CA1区注射Aβ25-35，建立阿尔茨海默病大鼠模型，探究大鼠脑脊液和海马组织中的儿茶酚胺氧位甲基转移酶与阿尔茨海默病模型大鼠学习记忆功能的相关性。

学习记忆功能主要分为获得、巩固和再现3个阶段，是中枢神经系统中的重要高级功能[13]。电刺激逃避主要用于评价动物的学习记忆功能，大鼠错误反应次数和潜伏期能够客观反映出动物的认知过程，具有操作简便、记录数据准确等优点[14]。因此，电刺激逃避法已经广泛于学习记忆功能的检测。阿尔茨海默病的临床表现主要为学习记忆功能的减退，因此，本研究测定了大鼠的学习记忆功能。有本研究结果发现，阿尔茨海默病模型组大鼠的潜伏期显著缩短，错误次数显著增加，发生了明显的学习记忆功能障碍，阿尔茨海默病严重损害了大鼠的学习记忆功能。

儿茶酚胺氧位甲基转移酶(COMT)广泛表达于哺乳动物的多种组织中，主要分为膜分泌型和膜结合型两种形式[15]。近年来的研究证实，COMT基因与多种肿瘤疾病的发生与发展相关，并在肿瘤组织中高表达，如子宫内膜癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等[16]。此外，COMT也广泛分布于神经组织，主要生理功能是使多巴胺等儿茶酚胺类神经递质失活，其机制是将甲基供体上的甲基转移到儿茶酚胺的3位和4位羟基上。COMT可降解60%位于人类前额叶皮质的多巴胺。研究发现，大脑控制性皮质损伤后，COMT的表达持续增高，并与行动迟缓和认知功能失常有关[17]。本研究通过实时定量PCR法测定了大鼠脑脊液和海马组织中COMT的mRNA表达量，结果显示阿尔茨海默病模型组大鼠脑脊液和海马组织中COMT的mRNA表达量均显著高于假手术组，说明阿尔茨海默病可提高大鼠脑脊液和海马组织中COMT的mRNA表达量。同时，本研究还通过Western blot测定了大鼠脑脊液和海马组织中COMT的蛋白表达量，结果发现，阿尔茨海默病模型组大鼠脑脊液和海马组织中COMT的蛋白表达量显著高于假手术组，说明阿尔茨海默病可上调大鼠脑脊液和海马组织中COMT的蛋白表达量，这与mRNA的表达结果相一致。

综上所述，阿尔茨海默病可严重损伤大鼠的学习记忆功能，并且首次揭示了COMT在AD大鼠脑脊液和海马组织中mRNA和蛋白的高表达，证实脑脊液和海马组织儿茶酚胺氧位甲基转移酶的高表达与阿尔茨海默病模型大鼠学习记忆功能具有显著相关性。这将为阿尔茨海默病的发病机制和治疗提供一定的理论依据。