教学用纯化水疱性口炎病毒抗原制备兔多克隆抗体结果分析

胡 涛，李 群，刘伯玉

（安徽医科大学，安徽 合肥 230032）

水疱性口炎病毒（VSV）可引起人畜共患疾病，是马、牛和猪等口腔黏膜、乳头、皮肤及蹄冠部皮肤出现水泡及糜烂为特征一种病毒性疾病，很少发生死亡[1]。人可通过与病畜接触而感染，症状类似感冒，一周后康复并产生中和抗体[2]。根据VSV可使Vero细胞（非洲绿猴肾细胞）产生细胞病变效应（CPE）[3]，本实验用纯化的抗原制备了兔抗VSV多克隆抗体，采用双向琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）、中和试验来测定血清效价。上述实验方法是我国对病毒性疾病进行流行病学调查、疫病诊断、防疫检测和免疫程序制订等工作的主要实验技术，也是目前高校医学微生物学实验课教学中学生操作的主要内容之一[4]，故通过建立实验教学检测方法的结果观察分析，可为课堂教学、VSV科研及流行病学调查提供可靠依据和技术保障。

1 材料

1.1 病毒株与细胞株

VSV毒株、Vero细胞株均由安徽医科大学微生物教研室提供。

1.2 动物

实验用兔由安徽医科大学动物中心提供。

1.3 试剂

完全佐剂和不完全佐剂由芜湖天明生物科技有限公司提供，HRP标记羊抗兔IgM为北京中杉金桥生物技术有限公司产品；包被液、抗体稀释液、显色液、底物液、终止液、封闭液均由安徽医科大学微生物教研室自制。

1.4 仪器设备

酶标仪（Biotek-EL808）、倒置生物显微镜（OLMPCUSCKX41）、CO2孵箱（日本株式社，日本）。

2 方法

2.1 纯化VSV抗原的制备

将VSV毒株接种于Vero单层细胞，DMEM无血清维持液，48小时细胞病变（CPE）达80%以上时收获病毒，4℃冻融3次，30 000 r/min，除去细胞碎片，上清液按文献[5]纯化抗原。经5 000 r/min离心30 min，取上清以30 000 r/min 4℃离心3小时，弃上清，将沉淀用少量PBS充分悬浮，获得VSV病毒，测其浓度及毒力并分装保存-80℃备用。

2.2 VSV抗原佐剂苗的制备

免疫前分别将弗氏完全佐剂和等量VSV抗原混匀，吸入20 mL注射器内，反复吹吸，直至形成黏稠的乳剂，滴于水上完全不扩散，不完全佐剂制备方法同上。

2.3 兔抗VSV多克隆抗体的制备

取体重为2～3 kg雄性、无感染疾患的兔共6只，分笼饲养，标明记号（a、b、c、d、e、f），实验前进行健康观察两周。免疫前兔耳静脉采血，分离血清，作为免疫血清阴性对照。免疫共5周，每周免疫注射家兔一次，第一次免疫VSV中加等量完全佐剂，采用多部位背部皮下注射2 mL VSV抗原，第二次抗原中等量加不完全佐剂，采用多部位腹部皮下注射2 mL VSV抗原，后3次免疫在兔耳静脉注射1 mL VSV抗原，后一周心脏抽血离心分离血清测定效价。

2.4 兔抗VSV多克隆抗体的双向琼脂扩散试验

实验用灭菌1%NaCl溶液将配制成1%琼脂液，将琼脂融化，稍冷后倾注于清洁载玻片上，每张载玻片上4～5 mL。正六角形打孔，孔距3～5 mm，孔径3～4 mm。将琼脂板标明记号，分别稀释待测血清原液、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32。加样：中央加1∶2的VSV抗原。其他6孔注入上述不同稀释度免疫血清VSV。静置：将上述琼脂板平置于一个垫有湿纱布的盒内，于室温24～48小时观察结果。

2.5 兔抗VSV多克隆抗体的间接ELISA法

将上述纯化VSV抗原，加96孔酶标板中做方阵滴定，获合适浓度，用pH 9.6碳酸缓冲液包被抗原，设正常抗原孔，每孔75 μL，4℃过夜，10%牛血清封板1小时后，洗涤甩干备用。待测免疫血清分别按1∶10不同浓度倍比稀释，每孔75 μL，放置37℃1小时，洗涤3次后，二抗为HRP标记羊抗兔IgM，用封板液稀释1∶5 000，每孔75 μL，37℃ 1小时后洗涤3次。显色：TMB A液及B液每孔各25 μL，与正常抗原孔比较，一般正常抗原孔不显色，其他显蓝色为阳性。以未免疫血清作为阴性对照，以待测血清OD值/阴性对照OD值（P/N）2.1作为阳性标准，以出现阳性反应最高稀释度作为该血清的抗体效价（滴度）。

2.6 兔抗VSV多克隆抗体的中和试验测定效价

实验前将预先被检血清（a、b、c、d、e、f）和阴性对照血清于56℃灭活30 min。方法：将血清在微量细胞培养板上以2倍系列稀释，血清稀释从1∶4开始，每份血清使用两排孔，第1孔加入100 μL，稀释至第8孔吸出100 μL弃去。第9孔细胞对照，第10孔病毒对照，均不加血清，预先按文献[6]配100TCID50VSV病毒悬液，按每孔100 μL加入，C细胞对照及血清S对照（即第1、9孔）不加病毒，V病毒对照加100TCID50100 μL。每孔总量200 μL，C对照及S对照补充稀释液100 μL/孔。37℃ 1小时，分别将1×106/mL Vero细胞悬液100 μL加入每孔，37℃ CO2孵育，48小时观察细胞病变效应（CPE）结果。

3 结果

3.1 VSV病毒的纯化

将细胞培养的VSV用超速离心纯化后，紫外分光光度计测其蛋白浓度为3.08 mg/mL。VSV接种Vero细胞的感染滴度为10-5/0.1 mL。

3.2 VSV抗原免疫接种后兔临床症状

观察兔发病，出现腹泻、消瘦、食欲减退或不食等症状。唇、口腔黏膜等处出现水疱，水疱破溃，形成烂斑，局部的皮肤发生炎症和脱毛。

3.3 兔抗VSV多克隆抗体的双向琼脂扩散试验

观察中间孔为VSV抗原，周围孔为不同稀释的免疫血清抗体，以出现沉淀线的最高稀释为抗体效价，出现沉淀带完全融合证明同种抗原，二者有部分相连表明二者有共同抗原决定簇，两条沉淀线相互交叉说明二者抗原完全不同，结果见图1。免疫血清检测抗体效价结果分别为：a为1∶16、b为1∶16、c为 1∶32、d 为 1∶16、e 为 1∶16、f为 1∶32。

3.4 兔抗VSV多克隆抗体的ELISA法

兔抗VSV做方阵滴定的最佳工作浓度为1∶800（5.16wg/mL）；酶标二抗的最佳稀释度为1∶5 000，6组VSV免疫血清IgM检测结果见表1。

表1 VSV-双向琼脂扩散和ELISA及中和抗体试验的结果比较

3.5 兔抗VSV多克隆抗体的中和试验测定效价

用倒置生物显微镜观察结果，首先观察对照：V对照（＋＋＋＋）、S对照（－/＋－）、C 对照（－），以病变作为指标，能抑制病毒CPE的血清最高稀释度为中和抗体效价（滴度）。6组VSV免疫血清中和试验测定效价结果见表2、图2。

表2 6组VSV免疫血清中和试验CPE测定效价结果观察

图2 中和试验（A细胞对照；B VSV滴度；C血清对照；D病毒对照）

3.6 兔抗VSV多克隆抗体实验方法结果的分析比较

6份血清中，双向琼脂扩散试验和间接ELISA与病毒中检测结果相符，见表1。其中双向琼脂扩散试验出现沉淀带完全融合证明同种VSV抗原，中和试验结果显示病毒回归成立，正常对照细胞生长良好。观察VSV免疫血清中和效价和间接ELISA效价，通过结果可见这两种方法检测血清的阴性对照、阳性对照是一致的。

4 讨论

上述实验证明，兔可被VSV感染导致出现临床症状，可用来研究病毒致病性与实验结果之间的关系。研究表明，实验采用纯化的全病毒免疫兔，可获得抗VSV所有结构蛋白的特异性抗体，而抗体的效价和纯度是影响ELISA敏感性的因素[7]，因此，对抗VSV进行了纯化，最大可能地降低了非特异性反应，从而提高了敏感性。纯化VSV能够被兔抗VSV阳性血清阻断，而不被兔抗VSV阴性血清阻断，双向琼脂扩散和ELISA及中和抗体试验的方法，表明该方法在检测其他相关病毒时不发生交叉反应，特异性良好。

建立上述实验方法是医学微生物学不同专业学生综合实验课的主要内容之一，包括高校八年制本博连读学生临床医学专业开设“病毒分离培养、鉴定及血清流行病调查”，研究生开设“细胞培养技术与传染病预防诊断”，卫生检验专业学生开设“动物免疫血清的制备与检测方法”实验课的内容，通过这些实验主要内容，学生可以通过这些实际操作观察分析病毒的免疫学检测方法结果，使本科生和研究生更好地熟悉和掌握传染病的诊断、治疗和预防等教学实践性内容，也可为血清学的检测提供依据。