高效液相色谱串联质谱法测定渔业水体及渔业饲料中的五氯苯酚

万译文， 黄向荣*， 伍远安， 李小玲， 肖 维， 杨 霄

（1.湖南省水产科学研究所，湖南长沙410153；2.水产健康生产湖南省协同创新中心，湖南常德415000；3.农业农村部渔业产品质量监督检验测试中心，湖南长沙410153）

五氯苯酚（PCP）简称五氯酚，是一种毒性较强的氯代酚类化合物，其化学结构稳定不易降解，通过食物链进入人体后富集，可造成中枢神经系统、肝肾损伤及内分泌紊乱（谭渝云，1996）。五氯苯酚曾在我国南方血吸虫病疫区被作为灭螺药而大量的使用，也有渔民使用五氯苯酚在清塘过程中灭杀杂鱼，因此五氯苯酚在水体和环境中残留还会持续很长一段时间，环境中残留的五氯苯酚依然会富集到生物体内。

目前已报道的五氯酚检测方法有：分光光度法（荣宝晶和崔杨卓，2005）、免疫法（Noguera等，2002）、气相色谱法（胡博等，2015；端礼钦等，2011）、液相色谱法（廖林川等，2004）、气相色谱-质谱法（史玉坤等，2015）。气相色谱法是各类物质中五氯苯酚检测的常用分析方法，由于五氯苯酚沸点高，难于汽化，因此需要进行衍生化处理后才能上机检测，而在衍生的过程中，对衍生温度、衍生时间、pH、反应时间等有较高的要求，因此，重现性差且回收率不高。本文旨在建立一种简单、快速、准确的高效液相色谱质谱联用测定渔业水体及渔业饲料中五氯酚的分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 五氯苯酚标准品（纯度大于98.9%），德国Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、二氯甲烷、甲醇、甲酸（色谱纯），德国Merk公司；乙酸铵（色谱纯），美国天地公司；Oasis HLB（6 mL/500 mg），美国waters公司；Oasis MAX（6 mL/500 mg），美国waters公司；超纯水，美国Milli-Q纯水系统制水。

1.2 仪器与设备 TSQ高效液相色谱-串联四级杆质谱联用仪，美国Thermo公司；M-X1R高速冷冻离心机，美国Thermo公司；平行旋转蒸发仪，瑞士Buchi（布奇）公司；MX-S旋涡混匀仪，美国Scilogex公司；固相萃取装置，美国SUPELCO公司；AUW120D超精密电子天平，日本岛津公司；KQ5200超声波清洗器，昆山超声波仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制 称取一定量的五氯苯酚标准品，用甲醇溶解定容配置成100 mg/L的标准储备液。使用时按照需要用流动相将上述标准储备液稀释成一系列不同浓度的标准工作液。

1.3.2 样品处理 地表水样品：将采集回来的水样1 L通过0.45μm水相滤膜过滤待用。准确量取50 mL水样，置于100 mL离心管中，用甲酸调节pH至2.0左右，涡旋混合30 s。将预处理的水样在不抽真空的条件下全部转移至已活化的HLB固相萃取柱中，待水样全部过完后，加入5 mL纯水进行淋洗并吹干，加入4 mL甲醇进行洗脱，收集全部洗脱液，于45℃下氮气吹干，准确加入1.0 mL甲醇-2 mmol/L乙酸铵溶液（2∶8，V∶V，含0.1%甲酸），漩涡混匀，过0.22μm微孔滤膜后，供液相色谱-串联质谱测定。

渔业饲料样品：称取匀浆后的样品5.00 g于50 mL离心管中，准确加入氨化乙腈（pH 9～10）10 mL，混匀2 min，放入超声机里超声5 min，放入离心机以8000 r/min离心5 min，离心后将上清液转移至25 mL离心管中，再次加入氨化乙腈提取一次，合并2次提取液并用氨化乙腈定容至25 mL。取5 mL提取液于45℃氮吹至干，加入2 mL 70%甲醇溶液，在漩涡混合仪上充分混合后，加入0.5 g C18吸附剂、0.5 g无水硫酸镁及0.2 g中性氧化铝，10000 r/min离心5 min，取上清液经0.2 mm滤头过滤，HPLC-MS/MS测定。

1.4 仪器条件

1.4.1 色谱条件 色谱柱为Capcell Pak C18（MGⅡ，50 mm×2.1 mm，1.9μm）；柱温为30℃，进样量为10μL，流动相A为甲醇；B为2 mmoL/L的乙酸铵溶液（含0.1%的甲酸）；梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序

1.4.2 质谱条件 采用大气压电喷雾离子源（ESI），负离子模式；喷雾电压为3000 V；毛细管温度为270℃；鞘气流速为0.17 L/h；辅助气流量为0.03 L/h；采用ESI+MRM多反应监测模式进行离子监测，五氯酚的监测离子对、碰撞能量、线性方程及相关系数见表2。

表2 4种化合物的SRM采集参数

2 结果与讨论

2.1 地表水前处理条件优化 五氯苯酚在水样中会进行分子解离和带电荷，水体中酸碱度大小的变化会改变五氯苯酚的离子化程度，进而影响五氯苯酚在HLB固相萃取柱上的吸附效果。本文采用甲酸和氨水对预处理后的水样进行调节，比较了pH为1.0～6.0不同酸碱度的水样，按照“1.3.2样品前处理”进行操作并上机测定该目标物的回收率后发现当水样的pH为2.0左右时，五氯苯酚主要以分子形态存在，抑制其电离作用，从而增加萃取效率，提高目标物的回收率。在固相萃取过程中，固相萃取填料的选择、样品酸碱度，上样的速率、洗脱剂的选择等都会影响固相萃取富集的效率，五氯苯酚结构中有极性较强的羟基使其极性较强，pKa值为4.74。HLB柱是一种亲水亲脂的反相固相萃取柱，pH为7.5，对亲水物质和亲脂物质具有均衡的保留能力，适合非极性、弱极性和极性化合物。本文重点研究了常用的C18、HLB、中性氧化铝等固相萃取柱，研究发现，HLB柱对目标物的萃取效率要高于C18和中性氧化铝柱，因此，本文选用HLB柱对水样进行富集和净化。

2.2 渔业饲料前处理条件优化 目前农药兽药残留常用的提取溶剂有乙腈、乙酸乙酯、甲醇、正己烷等有机溶剂，本文通过五氯苯酚的提取效率来比较这4种常用的有机溶剂。由五氯苯酚的回收率可知，乙酸乙酯对五氯苯酚提取的效率低，回收率为40%～50%；正己烷对五氯苯酚的提取效果较好，常用于对茶叶、饲料等物质中农药的提取，但是由于饲料中含有丰富的脂肪，而正己烷对脂肪的溶解度大，会加大后期样品净化的难度；乙腈和甲醇对五氯苯酚的提取效率也较高，由于甲醇的提取液中含有少量杂质，不利于净化过程，容易造成色谱柱堵塞。五氯苯酚在碱性环境中溶解度更大，因此本文采用氨化乙腈来提取。

目前，对渔业饲料样品的净化多采用固相萃取净化方式，根据五氯苯酚的结构特征，本文研究了常用的HLB、C18、Oasis MAX 3种固相萃取小柱对五氯苯酚回收率的影响，结果表明，当采用Oasis MAX固相萃取柱时，五氯苯酚的回收率最高，达到90%以上。这是由于HLB和C18小柱为反相固相萃取柱，目标物的极性越大在柱中的保留能力越弱。Oasis MAX柱是一种混合型阴离子交换柱，化合物的pKa值决定了其在MAX柱中的保留能力，只有当化合物的pKa值低于环境的pH时，化合物作为离子化状态而被柱填料吸附保留。五氯苯酚存在羟基而极性较强，pKa值为4.74，而MAX柱的吸附环境pH为7.0～7.5，五氯苯酚的pKa值小于环境的pH而被吸附保留在柱中，采用酸化甲醇可将五氯苯酚完全的洗脱下来。

2.3 色谱条件的选择及优化 在液质分析中，流动相多采用甲醇、乙腈和乙酸铵溶液，通过前处理净化降低色谱的本底值后，采用合适的梯度洗脱程序，能使目标物得到有效的分离和最佳的质谱响应信号。流动相的pH会影响目标物在色谱柱中的分离，本文同时比较了乙腈-水（0.1%甲酸）、甲醇-水（0.1%甲酸）、乙腈-乙酸铵水溶液（0.1%甲酸）、甲醇-乙酸铵水溶液（0.1%甲酸）4种不同的流动相对目标物的电离喷雾影响。试验发现，当采用甲醇-乙酸铵水溶液（0.1%甲酸）作为流动相时，使目标物色谱峰峰形尖锐、对称性好，色谱峰的响应强度高。五氯苯酚的SRM色谱图见图1。

图1 五氯苯酚标准溶液（10 ng/mL）的多反应监测色谱图

2.4 质谱条件的选择及优化 五氯苯酚苯环上连接着1个羟基[-OH]和5个氯原子，羟基[-OH]容易脱落1个H原子而形成[M-H]-离子峰，采用ESI负离子电离模式，将五氯苯酚标液进行一级全扫描，得到五氯苯酚的母离子。再将目标物的母离子施以碰撞能量得到不同响应强度的二级子离子，选择丰度最大的作为定量离子，丰度次强的作为定性离子。五氯苯酚标样中子离子264.7的响应值最大，因此选用264.7作为定量离子。在使用液质法进行检测时，本方法选择的子离子均符合欧盟657/2002/EC8规定的识别点要求。进一步优化电压、碰撞能量、鞘气与辅助气流量等质谱条件，使离子质谱响应信号达到最高。

2.5 方法的线性范围和检出限 将五氯苯酚标准储备液用初始流动相稀释成0.5～50μg/L的标准工作溶液，采用外标法定量，以五氯苯酚的质量浓度（μg/L）为横坐标，五氯苯酚定量离子的峰面积（Y）为纵坐标来制作标准曲线，可得五氯苯酚的回归方程和相关系数见图2。以3倍信噪比确定方法的LOD，10倍信噪比确定方法的LOQ，结合样品的前处理过程，经过样品添加试验计算后得到方法的检出限和定量限（表3）。

图2 五氯苯酚标准曲线

表3 五氯苯酚的线性方程、相关系数、检出限和定量限

2.6 方法的回收率和精密度 取空白水样和空白渔业饲料样品，制得浓度为0.1、0.5、1.0μg/L和2.0、10、20μg/kg 3个添加水平的加标样品，本方法采用外标法定量，按1.3.2节所述条件分别进行添加回收率和精密度试验。每个添加水平重复测定5次，其平均回收率及相对标准偏差结果见表4。

2.7 实际样品的测定 对长沙市周边的养殖鱼塘和湖泊等不同来源的地表水和长沙市农贸市场、超市待售的渔业饲料进行处理和测定。由结果可知，有3份养殖水样中检出五氯苯酚，其浓度值为0.64～1.22μg/L，说明仍有渔民在养殖过程中使用五氯苯酚作为杀虫剂。

表4 五氯苯酚在空白样品中的添加回收率和相对标准偏差

3 小结

本文建立了高效液相色谱串联质谱法测定渔业水体和渔业饲料中五氯苯酚残留量的检测方法。该方法线性关系良好，可在6 min内完成对目标物的分析，水样和渔业饲料样品的定量限分别为0.05μg/L和0.8μg/kg；该方法前处理简单快速、试剂用量少，采用质谱测定结果稳定可靠、准确度与精密度高。