LC-MS/MS法同时测定复方丹参颗粒和复方丹参滴丸中6种成分

2019-03-22 11:17文晓霞夏玉凤
中成药 2019年2期
关键词:滴丸丹参酮皂苷

洪 艳, 文晓霞, 李 莎, 于 凯, 夏玉凤∗

(1.金鸿药业股份有限公司研究所,广东珠海 519041;2.中国药科大学中药学院,江苏南京 211198)

复方丹参方由丹参、三七、冰片配伍组成,1977年由上海中药二厂研制成功并投入生产,方中丹参为君药,所含丹参酮ⅡA、隐丹参酮等脂溶性成分具有扩张冠状动脉、提高冠脉血流、保护心肌、广谱抑菌作用,而丹参素、原儿茶醛、丹酚酸等水溶性成分具有抑制血小板聚集、抗血栓形成、抗氧化、保护心脏微血管内皮细胞等作用[1-4];三七为臣药,主要有效成分为皂苷,具有抗血栓形成、扩张血管、保护心肌等作用[5-7];冰片为佐使药,引药入经,三药配伍,相辅相成,起到协同增效作用。

复方丹参方主要用于治疗冠心病心绞痛,在临床上因其疗效确切,不良反应少,而被开发成多种剂型,如2015版 《中国药典》就收载有复方丹参丸、片、胶囊、喷雾剂 (气雾剂)、颗粒、滴丸6种剂型[8],其药物组成、功能主治均相同,但处方中各药用量、生产工艺、质量标准等有所差异,其中复方丹参滴丸因服用方便、起效迅速而成为治疗冠心病心绞痛的急救药品,其药效物质基础及作用机制值得探讨。目前,有关复方丹参片与滴丸的质量分析、药理作用等方面的报道较多[9-11],而复方丹参颗粒是通过新型辅料及新工艺制成的颗粒剂,具有溶散时间短、释放速度快、防湿性能强、质量稳定、服用方便等特点,具有较好的市场应用前景,但相关研究较少。因此,本实验建立LCMS/MS法同时测定复方丹参颗粒和复方丹参滴丸中丹参素钠、三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、丹参酮ⅡA的含有量,以期为进一步比较两者作用特点提供参考依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260 LC System、Agilent 6420 Triple Quad LC/MS (美国 Agilent公司);SB-5200DT超声波清洗机 (宁波新芝生物科技股份有限公司);Sartorius BT25S电子天平;Direct-Q超纯水系统 (美国Millipore公司);TGL-16M高速台式冷冻离心机 (湖南湘仪仪器有限公司)。

1.2 试药 丹参素钠 (批号110855-201614)、三七皂苷 R1(批号 110745-201619)、人参皂苷 Re(批号 110754-201626)、人参皂苷 Rg1(批号110703-201731)、人参皂苷 Rb1(批号 110704-201625)、丹参酮ⅡA(批号110766-201721)对照品均购自中国食品药品检定研究院。复方丹参颗粒(金鸿药业股份有限公司,批号170509、170506、170422);复方丹参滴丸 (天津天士力制药股份有限公司,批号170421、161115、160531)。乙腈为色谱纯 (德国默克公司);甲醇为色谱纯 (江苏汉邦科技有限公司);甲酸为色谱纯 (上海克拉玛尔试剂);其他试剂均为分析纯;水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Eclipse Plus C18色谱柱 (3.0 mm×150 mm,3.5 μm);流动相乙腈 (A) -0.1%甲酸(B), 梯度洗脱 (0~1 min, 10%A; 1~2 min,10%~20%A;2~10 min,20% ~40%A;10~15 min, 40%A; 15~16 min, 40% ~98%A; 16~26 min,98%A,再运行 6 min);体积流量0.3 mL/min; 进样量 5 μL。

2.2 质谱条件 电喷雾电离源 (ESI),正、负离子快速切换多重反应监测模式 (MRM)检测,0~21 min为负离子模式,21~26 min为正离子模式;干燥气体N2,温度350℃,体积流量9 L/min;雾化器压力35 psi(1 psi=6.895 kPa);毛细管电压5 000 V(正离子模式)、4 000 V (负离子模式)。质谱参数见表1。

表1 各成分质谱参数Tab.1 MS parameters for various constituents

2.3 对照品溶液制备 精密称取丹参素钠、三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、丹参酮ⅡA对照品适量,置于5 mL量瓶中,甲醇溶解并稀释至刻度,得贮备液。分别精密量取适量于2 mL量瓶中,甲醇-0.1%甲酸 (50∶50)稀释至刻度,摇匀,即得(质量浓度分别为3 335.40、 2 888.00、 2 922.00、 1 834.56、 2 793.00、183.08 ng/mL)。

2.4 供试品溶液制备 取颗粒、滴丸适量,研钵中充分碾磨均匀,分别精密称取约10 mg,置于具塞棕色瓶中,加入25 mL 75%甲醇,称定质量,超声30 min,放冷,75%甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,两者续滤液加入甲醇-0.1%甲酸(50∶50) 分别稀释 10、 2倍, 12 000 r/min离心10 min,取上清液,即得。

2.5 专属性考察 吸取甲醇空白对照、对照品、供试品溶液适量,在 “2.1”项色谱条件下进样测定,结果见图1。由图可知,各成分峰形良好,阴性无干扰。

图1 各成分LC-MS/MS色谱图Fig.1 LC-MS/MS chromatograms of various constituents

2.6 线性关系考察 精密吸取 “2.3”项下对照品溶液适量,甲醇-0.1%甲酸 (50∶50)稀释成系列质量浓度,在 “2.1”和 “2.2”项条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标 (X),峰面积为纵坐标 (Y)进行回归,再分别以信噪比 S/N=10、S/N=3时的质量浓度作为定量限和检测限,结果见表2,可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.7 精密度试验 将同一对照品溶液在 “2.1”和 “2.2”项条件下进样测定6次,测得丹参素钠、三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷 Rb1、丹参酮ⅡA峰面积 RSD分别为0.41%、1.88%、2.42%、1.32%、1.76%、1.95%,表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验 取同一供试品溶液 (颗粒批号170509,滴丸批号170421),于室温下放置0、1、2、3、4、6 h后在 “2.1” 和 “2.2” 项条件下进样测定,测得颗粒和滴丸中丹参素钠、三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、丹参酮ⅡA峰面积 RSD分别为1.52%、4.91%、4.77%、 2.56%、 4.52%、 1.50% 和 2.02%、4.34%、4.78%、3.39%、4.11%、2.05%,表明供试品溶液在6 h内稳定性良好。

2.9 重复性试验 取同一批颗粒 (批号170509)和滴丸 (批号170421),按 “2.4”项下方法制备供试品溶液6份,在 “2.1”和 “2.2”项条件下进样测定,测得颗粒和滴丸中丹参素钠、三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、丹参酮ⅡA含有量 RSD分别为2.33%、4.83%、5.00%、 2.40%、 4.71%、 2.53% 和 1.45%、3.81%、4.83%、1.89%、5.01%、4.15%,表明该方法重复性良好。

2.10 加样回收率试验 精密称取含有量已知的颗粒 (批号 170509)和滴丸 (批号 170421) 各5 mg,精密加入500 μL对照品溶液,平行6份,按 “2.4”项下方法制备供试品溶液,在 “2.1”和 “2.2”项条件下进样测定,计算回收率。结果,颗粒中丹参素钠、三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、丹参酮ⅡA平均加样回收率分别为 96.64%、100.67%、98.79%、105.74%、99.18%、99.53%,RSD分别为 2.19%、 4.41%、 4.23%、 1.86%、 1.94%、4.88%;滴丸中各成分平均加样回收率分别为95.76%、98.95%、103.10%、102.25%、101.66%、104.59%,RSD分别为 2.18%、4.76%、3.72%、1.96%、4.45%、1.99%。

2.11 样品含有量测定 取不同批号颗粒、滴丸各3批,按 “2.4”项下方法制备供试品溶液,在“2.1”和 “2.2”项条件下进样测定,计算含有量,结果见表3。

表3 各成分含有量测定结果 (mg/g,n=3)Tab.3 Results of content determination of various constituents (mg/g, n=3)

3 讨论

3.1 提取溶剂选择 本实验考察了不同体积分数甲醇 (25%、50%、75%、100%)对6种成分提取率的影响,发现25%、50%甲醇提取时,丹参酮ⅡA提取率较低;甲醇提取时,丹参素钠提取率减少,并与75%甲醇提取时存在显著差异;75%甲醇提取时,各成分提取率均较高,故选择其作为提取溶剂。

3.2 色谱条件优化 本实验比较了不同型号、粒径的色谱柱,发现Eclipse Plus C18色谱柱 (3.0 mm×150 mm,3.5 μm)分离效果较好。再考察甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸 (含 10 mmol/L醋酸铵)、乙腈-0.1%甲酸等体系,发现在乙腈-0.1%甲酸条件下各成分响应更好,故选择其作为流动相。

3.3 质谱条件优化 由于各成分性质差异较大,故本实验通过离子检测模式对其进行考察,发现丹参素钠、三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1在负离子模式下响应较好,而丹参酮ⅡA在正离子模式下响应较好。为了使上述成分均有最高的灵敏度,本实验采用正负离子切换模式,从而确保它们均能在各自最佳电离模式下进行检测。

3.4 含有量分析 表3显示,除丹参素钠在复方丹参颗粒中含有量较低外,其他5种成分含有量均高于复方丹参滴丸。复方丹参颗粒和复方丹参滴丸是同一方剂衍生出的不同剂型,其功能主治相同,均为活血化瘀、理气止痛,但两者有效成分含有量差异较大,这将影响临床疗效。中药复方发挥疗效具有多成分、多靶点协同作用的特点,是一个复杂的体内过程,故药物作用强度除了与制剂中主要有效成分含有量密切相关外,有效成分作用方式、生物利用度、不同剂型对其体内吸收的影响等因素也将影响疗效。目前,针对复方丹参滴丸体内吸收特点有一些探索性研究[12-14],但鲜有复方丹参颗粒中有效成分药代动力学、作用机制及与剂型间关系的报道,本实验可为后期对该制剂进一步研究提供有价值的信息。

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