9省市19个产地野马追中2种活性成分测定及相关性分析

陈月桃， 吕伟旗， 潘晨曦， 邹慧龙

（丽水市人民医院药学部，浙江丽水 323000）

野马追系菊科多年生草本植物轮叶泽兰Eupatorium lindleyanum DC.的地上部分，秋季花初开时采割，晒干入药。其性平、味苦，归肺经，有清肺止咳、化痰平喘、降血压的功效，临床主要用于治疗慢性支气管炎、痰多、咳嗽、气喘、高血压等[1-2］。现代药物化学与药理学研究表明，野马追中含有萜类[3］、 黄酮类[4］、 甾体类[5］、 内酯类[6］、有机酸[7］等化合物，具有抗炎、抗病毒、抑菌、保护肺损伤等多种药理学活性[8-10］。

野马追在我国分布较广，除新疆外，其余各地均有分布，因南北跨度大，药材质量参差不齐，影响其资源利用与市场健康发展[11］。药材的产量和质量不仅受其自身遗传特性的影响，而且也与多种环境因素密切相关，在药材栽培实践中了解生境因子与药材质量和产量的相关性对提高药材品质具有重要意义。醇溶性浸出物与金丝桃苷含有量是2015年版 《中国药典》规定的野马追主要质量评价指标。本研究收集9省市19个产地野马追种质资源，对其醇溶性浸出物与金丝桃苷含有量进行考察，并分析其与生长性状、产地生境因子间的相关性，以期为野马追药材质量评价与种质资源可持续利用提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器与试剂 Milli-Q Academic超纯水仪 （美国Millipore公司）；DGG-9070电热恒温鼓风干燥器 （上海森信试验仪器有限公司）；600-2998型高效液相色谱仪 （美国Waters公司）；FA2004G型电子分析天平 （上海花潮实业有限公司）；FQ-1024型超声波清洗机 （杭州法兰特超声波科技有限公司）；HH-21-6型恒温水浴锅 （常州诺基仪器有限公司）；DF-300手提式粉碎机 （苏州奇乐电子科技有限公司）；SHB-ⅢA循环水式真空泵 （北京林茂仪器有限公司）。金丝桃苷对照品 （YZ-111521）购于北京索莱宝科技有限公司；色谱级甲醇、乙腈购于北京京科瑞达科技有限公司；分析用甲醇、乙醇、醋酸、磷酸等试剂购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 材料 2017年9月至10月，收集辽宁、湖北、重庆、吉林、湖南、浙江、江苏、山东、贵州9省市19个产地野马追资源，经丽水市人民医院药学部邹慧龙副主任药师鉴定为正品，信息见表1。

2 方法与结果

2.1 生长性状考察 取新鲜野马追植株，用卷尺测量株高，每株随机取3片叶片，用直尺测量叶片中脉长 （叶长），叶宽，计算叶长宽比，用游标卡尺测量茎中部粗 （茎粗），每个产地随机取20株。

2.2 醇溶性浸出物含有量测定 将新鲜野马追药材洗净，取地上部分，切段，50℃下烘干至恒定质量，粉碎过60目筛。取药材粉末2.0 g，加20 mL 60%乙醇，称定质量，80℃水浴回流1 h，冷却至室温，乙醇补足减失质量，精密吸取10 mL提取液置于质量为a的蒸发皿中，105℃下烘干至恒定质量，取出置于干燥器中冷却至室温，称定质量为b，计算醇溶性浸出物含有量。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2.3 金丝桃苷含有量测定

2.3.1 色谱条件 Waters Xbridge C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流动相乙腈-0.2%醋酸水；体积流量1.0 mL／min；检测波长255 nm；柱温26℃；进样量10 μL。

2.3.2 线性关系考察 精密吸取质量浓度为0.109 mg／mL的金丝桃苷标准溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL置于10 mL量瓶中，甲醇定容。取适量，过 0.45μm 微孔滤膜，在“2.3.1”色谱条件下测定，以峰面积为纵坐标（Y），标准溶液质量浓度为横坐标 （X），得回归方程为Y＝13 819X-17.2，R2＝0.999 6，表明金丝桃苷在0.010 9～0.065 4 mg／mL的范围内线性关系良好。

2.3.3 样品含有量测定 精密称取样品粉末1.0 g，加20 mL甲醇溶液，室温条件下超声 （功率250 W，频率33 kHz）提取40 min，抽滤，定容至25 mL量瓶，取适量，过0.45 μm微孔滤膜，在 “2.3.1”色谱条件下测定，试验平行3次，色谱图见图1。

图1 金丝桃苷HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of hyperoside

2.3.4 稳定性试验 随机取S14样品，按“2.3.3”项下方法制备样品溶液，阴凉密闭放置0、 2、 4、 8、 12、 16、 24 h后， 在 “2.3.1” 项条件下进样，测得S14样品含有量RSD 1.07%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.5 精密度试验 取同一对照品溶液，在“2.3.1”项色谱条件下连续进样6次，测得金丝桃苷平均峰面积RSD 0.93%，表明仪器精密度良好。

2.3.6 重复性试验 随机取S7样品6份，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，测定样品中金丝桃苷含有量，得S7样品平均含有量 RSD 2.30%，表明该方法重复性良好。

2.3.7 加样回收率试验 随机取已知金丝桃苷含有量的S10样品，按照低、中、高3个质量浓度加入适量金丝桃苷对照品，按 “2.3.3”项下方法制备供试品溶液，测定样品中金丝桃苷含有量，计算加样回收率，见表2。

表2 各成分加样回收率试验结果 （n＝6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents （n＝6）

2.4 数据处理与分析 用 SPSS23.0与EXCEL2010软件处理数据，采用单因素ANOVA分析，聚类分析采用组间联接法，区间测量采用欧式距离。

2.5 结果与分析

2.5.1 生长性状、有效成分含有量测定 19个产地野马追生长性状、醇溶性浸出物、金丝桃苷含有量存在显著性 （P＜0.05）或极显著性 （P＜0.01）差异。生长性状方面，江苏种质野马追表现优良，其中句容样品植株最高，平均株高1.32 m，金坛样品茎粗、叶长、叶宽指标最高，分别为0.61、10.02、2.41cm；供试野马追醇溶性浸出物平均含有量为13.34%，金丝桃苷平均含有量为0.696 9 mg／g，其中江苏金坛醇溶性浸出物、浙江缙云金丝桃苷含有量最高，分别为17.94%、0.931 2 mg／g，湖北房县样品醇溶性浸出物、辽宁本溪金丝桃苷含有量最低，仅为9.12%、0.463 9 mg／g。样品均符合2015年版 《中国药典》 规定的标准[1］，见表3。

2.5.2 相关性分析 野马追醇溶性浸出物、金丝桃苷含有量与生长性状、产地生境因子间存在相关性，见表4。可知，醇溶性浸出物含有量与株高、茎粗、叶长、叶宽、叶长宽比、经度呈正相关，其中与叶长呈最大正相关，相关系数为0.829 7；与纬度呈负相关，相关系数为0.434 4；与海拔相关性较低，相关系数仅为0.070 7；金丝桃苷含有量与株高、茎粗、叶长、叶宽、叶长宽比、经度、海拔呈正相关，其中与叶宽呈最大正相关，相关系数为0.758 4；与纬度呈负相关，相关系数为0.484 7。表明，高海拔、高经度、低纬度地区栽培野马追有利于提高药材中醇溶性浸出物与金丝桃苷含有量积累。

表3 不同产地样品生长性状与活性成分含有量比较Tab.3 Comparison of growth traits and active ingredient contents of samples in different growing areas

表4 活性成分含有量与生长性状、生境因子相关性分析Tab.4 Correlation analysis between active ingredient contents and growth traits，habitat factors

2.5.3 聚类分析 根据欧式距离D2＝13.08可将供试19个产地野马追划分为3个类群，见图2。第Ⅰ类群共6个产地，分别为浙江庆元、浙江临安、浙江磐安、浙江缙云、江苏句容、江苏金坛。该类群以江浙野马追为主，植株较高，茎秆粗壮，叶片大而多狭长，醇溶性浸出物含有量与金丝桃苷含有量较高；第Ⅱ类群共8个产地，分别为吉林通化、贵州台江、贵州独山、湖南蓝山、湖南岳阳、吉林船营、山东招远、重庆綦江。该类群以吉林、贵州与湖南产地为主，植株较矮，茎秆细，叶片较小而多宽钝，醇溶性浸出物与金丝桃苷含有量较低；第Ⅲ类群共5个产地，分别为湖北神农架、山东泰安、辽宁义县、辽宁本溪、湖北房县。该类群以湖北与辽宁产地为主，植株中等高度，茎秆中等粗度或较细，叶片较小而多狭长，醇溶性浸出物与金丝桃苷含有量较低。

图2 19批样品聚类树状图Fig.2 Dendrogram of nineteen batches of samples

3 讨论

在2015年版 《中国药典》与已有报道基础上[1，12-13］， 本研究考察了不同流动相 （甲醇-水、乙腈-0.2%磷酸水、乙腈-0.2%醋酸水），提取方式（加热回流提取、索式提取、超声提取）与提取时间 （30、40、50、60 min）对野马追中金丝桃苷含有量测定的影响，结果表明以甲醇为提取溶剂，在25℃下超声提取 40 min，即可提取完全。在“2.3.1”项色谱条件下金丝桃苷出峰时间为7.963 min， 定量限为 2.58 μg／mL， 检测限为1.12 μg／mL。

药用植物在长期与环境因素，包括生物性因素与非生物性因素的适应过程中，其生长发育受自身遗传与环境因素的双重影响[14-15］。非生物性因素包括经度、纬度、海拔、光照、水分等。本研究在收集野马追药材种质资源的基础上，考察了其主要质量评价指标醇溶性浸出物、金丝桃苷含有量与生长性状、生境因子之间的相关性，表明我国主分布区野马追药材质量较好，多样性丰富，为野马追良种选育提供了较好的备选种质；相关性结果表明在高经度、高海拔、低纬度地区种植野马追有利于其金丝桃苷含有量积累，野马追良种选育可优先在江苏、浙江种质中选择。

中药材生长发育过程中，各环境因子间往往具有关联性[16］，本研究下一步将在野马追优良种质资源筛选的基础上，开展同一区域内不同海拔对野马追醇溶性浸出物与金丝桃苷成分含有量积累的影响分析，以减少经度、纬度等环境因子与海拔因子间互作关联性对药材质量评价的影响。此外，本实验收集的资源中，部分省市如重庆只收集到1个种质，区域代表性不强，其他分布区如云南、江西等地未收集到种质，后续工作将加强对上述产地野马追药材的收集与质量评价工作。