依达拉奉对心搏骤停大鼠心肌保护作用及水通道蛋白4、水通道蛋白9的作用

李丽

心搏骤停(cardiac arrest，CA)是临床上最为常见的危重症之一，是造成心脏猝死主要原因[1]。CA具有高致残率、高病死率以及低复苏成功率等特点，病情凶险，严重危害了我国居民的身体健康及生命安全[2]。心肺复苏(CPR)是临床治疗CA的关键性抢救措施[3]，但目前临床CA复苏成功率仍很低。有效提高CA病人复苏成功率，延长病人生存时间是目前临床亟待解决的关键问题。本研究采用依达拉奉干预CPR后CA模型大鼠，取得良好效果，现作如下报告。

本研究起止时间为2014年1月至2016年2月。

1 材料与方法

1.1动物来源96只健康SD大鼠，体质量范围为220～260 g，购于北京华阜康科技有限公司。

1.2主要材料与仪器依达拉奉注射液(每支30 mg，生产批号：20140509)，购于西安利君制药有限责任公司；ALC-V9动物呼吸机，购于北京吉安得尔科技有限公司；BL-420F生物机能实验系统，购于成都泰盟科技有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)试剂盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒，购于长沙赛晶生物科技有限公司；Trizol、DEPC、反转录试剂盒、SYBR PrimeScript RT-PCR Kit，购于日本TaKaRa公司；DNA Marker，购于天根生化科技有限公司；Real-Time PCR仪ABI7500，购于美国ABI公司；水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP4)、AQP9、β-action PCR引物，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3方法

1.3.1模型建立及分组处理 将大鼠采用随机数字表法分为假手术组(28例)，依达拉奉组(34例)、生理盐水组(34例)，依达拉奉组及生理盐水组采用腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，气管插管备接呼吸机，动、静脉置管，待大鼠血流动力学稳定后，经食道采用快速起搏法诱导CA。CA造模成功5 min后，开始实施CPR，待自主循环恢复后，依达拉奉组立即静脉注射3 mg/mL依达拉奉，生理盐水组给予等体积生理盐水，假手术组不诱导CA模型，仅进行动、静脉置管及气管插管。连续监测三组心电图及血流动力学1 h后缝合伤口，待依达拉奉组和生理盐水组中所有大鼠造模苏醒后拔除插管，放入笼中常规饲养。

CA造模成功标准：动脉搏动波消失，并且平均动脉压<10 mmHg，心电图显示无脉性电活动或心室颤动呈一条直线。

自助循环恢复标准：心电图显示出现包括房性、窦性或者交界性室上性节律，平均动脉压>20 mmHg，并持续超过5 min。

1.3.2观察指标 分别于自主循环恢复后12、24、48、72 h，观察以下指标：(1)测定三组大鼠各个时间点心肌组织中SOD、MDA水平，具体操作严格按照试剂盒使用说明进行；(2)光学显微镜下观察三组不同时间点心肌病理学变化；(3)测定三组不同时间点脑组织含水量，脑组织含水量=(脑湿重-脑干重)/脑湿重×100%；(4)采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测三组不同时间点脑组织AQP4、AQP9 mRNA水平。

1.3.3RT-PCR检测AQP4、AQP9 mRNA水平 自主循环恢复后12、24、48、72 h后处死大鼠，采用Trizol抽提法提取脑组织总RNA，按照反转录试剂盒使用说明进行反转录。反转录得到的cDNA用作RT-PCR检测AQP4、AQP9 mRNA水平的模板。设计好的AQP4、AQP9以及内参β-action引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列见表1。

反应条件：92 ℃预变性4 min；92 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，重复30个循环；72 ℃延伸10 min。取5 μLPCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像仪扫描成像。凝胶成像仪对电泳图像进行分析处理后，以AQP4、AQP9 mRNA光密度值占β-action mRNA光密度值百分比为AQP4、AQP9 mRNA相对含量。公式：AQP4相对含量=(AQP4 mRNA光密度值/β-action mRNA光密度值)×100%，AQP9 mRNA光密度值=(AQP9 mRNA光密度值/β-action mRNA光密度值)×100%。

2 结果

2.1三组大鼠处理前基础参数比较三组大鼠体质量、平均动脉压、舒张压、收缩压及心率等基础参数比较，均差异无统计学意义(P>0.05)。具体结果见表2。

2.2三组大鼠心肌组织SOD、MDA水平比较12、24、48、72 h处死大鼠，假手术组心肌组织中SOD水平均明显高于依达拉奉组、生理盐水组(P<0.05)，MDA水平明显低于依达拉奉组及生理盐水组(P<0.05)，依达拉奉组心肌组织中SOD水平均明显高于生理盐水组(P<0.05)，MDA水平明显低于生理盐水组(P<0.05)。结果见表3,4。

2.3三组大鼠心肌组织病理形态比较光学显微镜下观察三组大鼠不同时间点心肌组织病理形态可见，12 h处死大鼠，假手术组大鼠心肌纤维互联成网，排列整齐，细胞核染色均匀，细胞间隙正常，闰盘清晰染色较深；依达拉奉组可见心肌组织存在散在片状坏死灶，心肌细胞间隙增大，核染色变浅；生理盐水组心肌组织弥漫性坏死，较之依达拉奉组更甚。24、48 h处死大鼠，生理盐水组心肌组织坏死程度及范围均明显较依达拉奉组严重，坏死心肌纤维排列松散紊乱，核染色较淡甚至消失。72 h处死大鼠，生理盐水组心肌坏死程度明显高于依达拉奉组，心肌纤维断裂，细胞核稀疏。见图1。

表1 AQP4、AQP9 及内参β-action引物序列

表2 三组大鼠处理前基础参数比较结果

表3 三组大鼠SOD水平比较结果

注：与假手术组比较，aP<0.05；与生理盐水组比较，bP<0.05

2.4三组大鼠脑组织含水量比较12、24、48、72 h处死大鼠，生理盐水组脑组织含水量均明显高于依达拉奉组、假手术组(P<0.05)，且假手术组与依达拉奉组脑组织含水量比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表5。

2.5三组大鼠AQP4、AQP9mRNA水平12、24、48、72 h处死大鼠，依达拉奉组AQP4、AQP9 mRNA水平均明显低于生理盐水组(P<0.05)。具体结果见表6,7。

3 讨论

CA发生时，心脏失去正常泵血功能导致机体组织器官因缺氧缺血而发生损伤，随着CA时间延长，组织损伤愈严重。及时实施CPR有望逆转CA过程，但目前临床CA复苏成功率以及病人远期生存质量仍然不佳。相关资料显示[4]，北美洲每年大约有50万人接受CPR，但仅有20%～50%病人自主循环恢复，且仍有许多病人在自主循环恢复后死亡。CA复苏成功率低与组织器官缺氧缺血时间长短以及继发缺血性再灌注密切相关[5]。研究表明[6]，氧自由基在组织缺血再灌注损伤过程中起重要作用。依达拉奉具有有效清除氧自由基的作用而被广泛应用于临床脑卒中治疗方面[7-8]，但其在CA后CPR过程中是否具有保护作用尚未完全清楚。因此，本研究旨在探讨依达拉奉干预CPR后CA模型大鼠对心肌组织及脑组织的保护作用，试图为依达拉奉应用于临床CA治疗提供一定理论依据。

表4 三组大鼠MDA水平比较结果

注：与假手术组比较，aP<0.05；与生理盐水组比较，bP<0.05

表5 三组大鼠脑组织含水量比较结果

注：与假手术组比较，aP<0.05；与生理盐水组比较，bP<0.05

表6 三组大鼠AQP4 mRNA水平比较结果

注：与假手术组比较，aP<0.05；与生理盐水组比较，bP<0.05

表7 三组大鼠AQP9 mRNA水平比较结果

注：与假手术组比较，aP<0.05；与生理盐水组比较，bP<0.05

SOD是机体超氧阴离子清除剂，其活性水平可有效反映清除机体氧自由基能力及抗氧化应激能力，MDA是机体氧自由基攻击不饱和脂肪酸而引发脂质过氧化的标志性产物[9]，其表达水平可间接反映机体受到氧自由基攻击严重程度。依达拉奉具有较强亲脂性，是机体自由基的捕获剂，可快速到达组织降低羟自由基水平，发挥强大抗氧化作用[10-11]。本研究结果表明，12、24、48、72 h处死大鼠，假手术组心肌组织中SOD水平均明显高于依达拉奉组、生理盐水组，MDA水平明显低于依达拉奉组及生理盐水组，依达拉奉组心肌组织中SOD水平均明显高于生理盐水组，MDA水平明显低于生理盐水组，提示依达拉奉可有效清除机体氧自由基，从而减少MDA生成，减少SOD消耗，从而起到减轻心肌组织氧化应激损伤作用；病理学观察结果可见，各时间点生理盐水组心肌病理学损伤程度均高于依达拉奉组，说明依达拉奉干预CA后CPR模型大鼠可减轻心肌组织损伤，起到有效心肌保护作用；CA后实施CPR的最终目的是尽可能保护及恢复病人完整脑功能，依达拉奉具有分子量很小，水溶性及脂溶性特点，因此十分容易穿透机体血脑屏障，在脑组织中发挥强大神经保护作用。AQP4是一类主要分布于软脑膜、脑室管膜的通道蛋白，是脑胶质细胞与血管及脑脊液间水分转运、调节的重要结构基础[12]。研究表明[13]，AQP4在脑出血后大量自由基导致脑水肿形成过程中扮演重要角色，AQP4可能与自由基之间存在着某种联系。目前，AQP4已成为脑水肿形成研究的重要热点。研究表明[14-15]，脑组织AQP9过度表达与机体脑水肿形成同样存在密切关系。本研究结果显示，12、24、48、72 h处死大鼠，依达拉奉组脑组织含水量均明显低于生理盐水组，依达拉奉组AQP4、AQP9 mRNA水平均明显低于生理盐水组，由此可见，依达拉奉可有效减轻CA后实施CPR脑水肿，且对AQP4、AQP9 mRNA表达具有下调作用，因此笔者推测，依达拉奉减轻大鼠脑水肿的作用机制为下调了脑组织中AQP4、AQP9基因的表达。

综上所述，本研究结果表明，依达拉奉可减轻CA大鼠CPR后心肌损伤，可通过下调AQP4、AQP9表达减轻大鼠脑水肿，由于CA发病机制复杂，依达拉奉具体通过哪些信号通路发挥治疗作用，有待更进一步深入研究。

(本文图1见插图4-2)