基于溶血率的金银花与山银花质量差异研究

徐玉玲, 郑 燕，叶 萌, 梁 鑫,王 晨，潘春晖，杨红玉

(1.成都大学 药学与生物工程学院，四川 成都 610106；2.四川德成动物保健品有限公司，四川 德阳 618000)

0 引 言

金银花为忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或带初开的花.“金银花”一名，始载于宋代方书《苏沈良方》，至明代《本草纲目》，除藤叶药用以外，开始强调以花入药[1].药理研究表明，金银花具有抑菌、抗病毒、解热及降血脂等作用[2].山银花为忍冬科植物灰毡毛忍冬、红腺忍冬、华南忍冬或黄褐毛忍冬的干燥花蕾或带初开的花[1].山银花具多种药理作用，具有抑菌杀菌、抗病毒、抗炎、抗过敏和肝脏保护等作用[3].杨倩茹等[4]对金银花与山银花化学成分进行研究表明，金银花较山银花含有较丰富的环烯醚萜类和黄酮类化合物，而山银花中三萜皂苷类化合物种类较多.目前，金银花是中药注射剂中的常用组分，如清开灵注射液、热毒宁注射液、注射用双黄连冻干粉等[5].据文献报道，皂苷类成分一般具有溶血作用，当其制备成注射剂时，需考虑其溶血风险[6-9].对此，本实验对比分析了金银花药材与山银花药材的体外溶血作用，拟对二者的内在质量进行分析评价.

1 材料与仪器

1.1 材 料

实验所用材料包括：金银花、山银花药材购置于不同药店，经成都大学刘涛研究员鉴定，山银花药材品种为灰毡毛忍冬，金银花与山银花药材来源分别见表1、表2；0.9% NaCl注射液(批号，B15042001)，购自四川科伦药业股份有限公司；水为蓝光纯净水，其余试剂均为分析纯；新西兰大白兔(合格证号，SCXK(川)2013-17)，购自成都达硕实验动物有限公司.

表1 金银花来源

表2 山银花来源

1.2 仪 器

实验所用仪器包括：TU-1810PC型紫外—可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；BS-6KH型电子分析天平(上海友声衡器有限公司)；HS-3120型超声清洗器(天津恒奥科技发展有限公司)；HH-6型数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)；TD5型离心机(长沙英泰仪器有限公司).

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

取金银花粉末1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入70% 甲醇溶液100 mL，称重，超声处理20 min，称其质量，用70% 甲醇溶液补足减失的质量，摇匀，滤过.取续滤液50 mL于蒸发皿(多次加入)，于70 ℃水浴蒸干，加入40 μL二甲基亚砜，超声助溶，再加入生理盐水进行稀释，将该溶液置于100 mL量瓶中，定容，得金银花样品储备液.取储备液适量，加生理盐水分别稀释成含金银花质量浓度为0.5 g/L、1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L的供试品溶液[5].同时，采用相同方法制备山银花样品的供试品溶液.

2.2 红细胞混悬液的制备

从实验家兔耳缘静脉取新鲜血液20 mL，置烧杯中，用缠有少量脱脂棉的玻璃棒轻轻搅拌10 min，取出血液中的纤维蛋白，制成脱纤血液，加入约10 倍量生理盐水，摇匀，于3 000 r/min离心10 min，弃去上清液.按此方法重复4～5次，洗至上清液呈无色透明，将所得红细胞用生理盐水配制成压积为2% 的红细胞混悬液，置于4 ℃冰箱中保存，备用[10].

2.3 溶血率的测定

溶血率采用紫外—可见分光光度法进行测定，具体步骤为：

以3 mL生理盐水中加入兔红细胞混悬液 3 mL为阴性组；以3 mL水中加入兔红细胞混悬液3 mL为阳性组(渗透压的改变造成红细胞完全溶血)；以按“2.1”项下供试品溶液制备方法制备的不同质量浓度的金银花供试品溶液与山银花供试品溶液各3 mL分别加入兔红细胞混悬液3 mL作为样品组.将各组溶液轻轻振摇，混合均匀，置(37±0.5)℃恒温培养箱中保温3 h，保温完毕取出，于2 000 r/min离心10 min，吸取上清夜至比色皿中.以阴性组为空白，采用比色法于540 nm波长下分别测定阳性组的吸光度(A阳)和样品组的吸光度(A样).由于金银花与山银花供试品溶液具有吸光度，因此加入兔血后测出的吸光度需减去金银花与山银花供试品溶液的吸光度(A空).并按照溶血率=(A样-A空)/A阳×100%，计算溶血率.

2.4 实验结果

3批金银花样品与3批山银花样品不同质量浓度下的溶血率见表3、表4.

表3 金银花样品不同质量浓度下溶血率

表4 山银花样品不同质量浓度下溶血率

3 结果分析

3.1 相似度分析

将3批金银花样品作为一组标准样品，利用数据处理软件“IBM SPSS statistics"中双变量相关“Kendall的tau-b"依次对3批山银花样品进行相似度分析，并进行相似度测算，结果见表5.

表5 金银花与山银花样品相似度分析表

由表5可知，金银花样品与山银花样品溶血率相似度最高为73.3%，最低为27.6%.此表明，金银花样品的内在质量与山银花样品的内在质量存在差异.

3.2 溶血率—质量浓度曲线分析

将3批金银花药材及3批山银花药材在不同质量浓度下的溶血率计算平均值，建立溶血率—质量浓度曲线，结果见图1.

由图1(H1)可见，当金银花样品溶液质量浓度≤1.0 g/L时，不存在体外红细胞溶血现象；在质量浓度为2.0 g/L时溶血率急剧增大；在质量浓度为4.0 g/L时，溶血作用基本达到最大；在质量浓度为5.0 g/L时溶血率基本达到平衡.

由图1(H2)可见，当山银花样品溶液质量浓度≤1.0 g/L时，不存在体外红细胞溶血现象；在质量浓度为2.0 g/L时溶血率急剧增大，在质量浓度为3.0 g/L时，溶血作用基本达到最大，在质量浓度为4.0 g/L时溶血率基本达到平衡.

图1金银花、山银花样品溶血率—质量浓度曲线

实验结果表明，金银花样品的最大溶血率小于山银花样品，且达到最大溶血率的质量浓度较山银花大，说明金银花样品与山银花样品内在质量存在差异，其原因是金银花样品含皂苷类化合物较山银花少.

3.3 “Smirnov”分析

根据判定“可疑值"能否舍弃的“Smirnov"法，以3批金银花不同质量浓度下溶血率为一组，判定每一批山银花样品的相似度Ti是否为可疑值，如为可疑值，应该舍弃不用.

Ti=|(Xi-X)|/S

式中，Xi为可疑值，X为包括可疑值在内的平均数，S为标准差[11].

查询“Smirnov”法附表，n=4时，Ti>1.689，表明有显著性差异.不同质量浓度下样品的Ti值见表6.

表6 金银花样品与山银花样品可疑值分析表

由表6可知，r2的Ti(1 g/L)与Ti(5 g/L)的Ti值>1.689，r3的Ti(2 g/L)的Ti值>1.689，其余值均<1.689，表明山银花样品中r2的Ti(1 g/L)、Ti(5 g/L)与r3的Ti(2 g/L)为可疑值，应舍去，即山银花样品r2、r3与3批金银花样品比较，具有显著性差异.

3批山银花药材样品中，有2批样品与金银花样品存在显著性差异，表明金银花药材与山银花药材溶血作用存在显著性差异.

4 讨 论

黄娜等[5]研究表明，金银花药材与山银花药材具有体外溶血作用，作为注射剂时，具有潜在溶血风险，溶血作用的产生源于二者皂苷的含量，本研究基于金银花药材与山银花药材存在体外溶血的作用，采用紫外—可见分光光度计法对二者溶血作用进行分析，通过二者溶血作用差异，进一步说明二者的皂苷种类与含量存在差异，继而说明金银花药材与山银花药材内在质量存在差异.现有文献对二者进行质量分析时，均对二者主要成分及含量进行分析，缺少对各成分间相互作用的研究，本实验基于二者药效作用分析，进一步表明二者存在差异.

本研究采用“IBM SPSS Statistics”软件分析了金银花标准样品组与山银花各批次之间差异，表明二者相似度较低；采用溶血率—质量浓度曲线分析，金银花样品出现溶血率最大值时质量浓度较山银花样品大，表明金银花样品皂苷含量较山银花样品少；采用“Smirnov"分析，表明山银花样品与金银花样品存在显著性差异.3种分析方式的联用，均表明二者质量间存在差异.

研究发现，不同批次金银花样品间相同质量浓度下溶血率相差较大，质量浓度为3 g/L时，RSD为80.29%；不同批次山银花样品间相同质量浓度下溶血率相差也较大，质量浓度为2 g/L时，RSD为130.95%.此表明金银花样品与山银花样品间差异可能来源于药材本身，且本实验仅基于品种为灰毡毛忍冬的山银花药材的研究，不能说明金银花药材与山银花药材内在质量存在较大差异.此表明，在分析药材间质量时，需对药材本身质量进行探讨，而现有文献缺乏该方面讨论.

此外，金银花药材与山银花药材质量浓度为2 g/L时已出现体外溶血.体外溶血率与甲醇浓度、超声时间、二甲基亚砜用量及样品保温时间存在较大联系，当上述条件发生变化时，会出现溶血率降低甚至不出现溶血的状况.杨光[12]研究表明，皂苷可以同血红细胞壁上的胆甾醇结合生成不溶性分子复合物沉淀，造成血红细胞正常渗透性被破坏而发生崩解，进而产生溶血作用.本实验样品制备方式极大程度提取了皂苷，从而发生了体外溶血作用.

本研究采用体外溶血作用对金银花药材与山银花药材内在质量的分析克服了现有文献对主要成分分析的不完整性，也进一步说明了中药作用的多成分、不确定性，实验方法与结果为中药内在质量差异研究提供了一种新的思路.