Lgr5和β-catenin蛋白在胃癌组织中的表达

侯震涛 冀子中 邬万新等

[摘要] 目的 探究胃癌组织中Lgr5和β-catenin蛋白表达的差别及相关性。 方法 选择2012年1月～2017年12月间嘉兴市第一医院80例胃癌患者组织病理标本作为观察组，30例浅表性胃炎患者组织病理标本和30例萎缩性胃炎患者组织病理标本分别作为对照组，采用免疫组化法检测Lgr5和β-catenin蛋白的表达。 结果 Lgr5和β-catenin蛋白在观察组中的表达率高于对照组，三者之间存在显著差异（χ2=12.937、13.654，P均<0.05）。Lgr5蛋白在胃癌中的表达与患者的组织分化程度及患者的肿瘤TNM分期存在明显相关性（P均<0.05）;β-catenin蛋白在胃癌中的表达与患者是否存在淋巴结转移以及患者的肿瘤TNM分期存在明显相关性（P均<0.05）。同时，在胃癌组织中，Lgr5和β-catenin蛋白的表达呈明显相关性（rp=0.226，P=0.038）。 结论 在胃癌的发生发展过程中，Lgr5 和 β-catenin蛋白发挥着重要作用，二者的检测对于胃癌的靶向诊疗意义重大。

[关键词] Wnt信号通路;胃癌;Lgr5;β-catenin

[中图分类号] R735.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2019）04-0001-05

[Abstract] Objective To investigate the difference and correlation of Lgr5 and β-catenin protein expression in gastric cancer tissues. Methods Histopathological specimens of 80 gastric cancer patients in Jiaxing First Hospital from January 2012 to December 2017 were selected as observation group. Histopathological specimens of 30 superficial gastritis patients and 30 atrophic gastritis patients were selected as the control group. The expression of Lgr5 and β-catenin protein was detected by immunohistochemistry. Results The expression rates of Lgr5 and β-catenin in the observation group were higher than those in the control group， and there were significant differences among the three groups（χ2=12.937 and 13.654， P<0.05）. The expression of Lgr5 protein in gastric cancer was significantly correlated with the degree of tissue differentiation and the TNM stage of patients（P<0.05）. There was a significant correlation between the expression of β-catenin protein in gastric cancer and whether the patient had lymph node metastasis and tumor TNM stages（P<0.05）. At the same time， the expression of Lgr5 and β-catenin protein was significantly correlated in gastric cancer tissues（rp=0.226， P=0.038）. Conclusion Lgr5 and β-catenin proteins play an important role in the development of gastric cancer. The detection of these two is of great significance for the targeted diagnosis and treatment of gastric cancer.

[Key words] Wnt signaling pathway; Gastric cancer; Lgr5; β-catenin

胃癌是全球第二大癌癥相关死亡原因，尽管目前在手术、化疗、放疗、靶向分子治疗等方面均取得了长足进展，但晚期胃癌患者的5年生存率仍然较低[1]。因此，识别新的诊断和预后标志物，对于进一步阐明胃癌进展的机制及其预防和治疗至关重要。近年来，肿瘤干细胞（CSCs）对肿瘤生长和转移的重要性得到了公认，CSCs是具有自我更新功能的多能细胞，对胃癌的增殖、转移具有重要作用[2]，Wnt/β-catenin信号通路的异常激活参与了胃癌CSCs的调控[3]。在人类的进化过程中，Wnt/β-catenin信号通路高度保守，目前普遍认为，Wnt /β-catenin信号通路通过参与多种人类生理活动与肿瘤的形成，胃癌的发生和发展密切相关[4]。作为Wnt信号通路的重要组成部分之一，富含亮氨酸重复序列G蛋白偶联受体5（Lgr5）在多种肿瘤中存在异常表达，参与了CSCs增殖分化异常的过程，是不可或缺的重要因素之一[5]。作为Wnt/β-catenin信号通路中的关键蛋白，β-连环蛋白（β-catenin）在Wnt信号通路中扮演着重要的角色，其异常表达与多种肿瘤的发生发展关系密切[6]。本研究通过联合检测胃癌、萎缩性胃炎和浅表性胃炎组织中Lgr5和β-catenin蛋白的表达，对二者在胃癌进展过程中发挥的作用进行探讨，并最终为胃癌的诊疗以及改善患者的预后提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本次研究随机选取的标本均取自嘉兴市第一医院2012年1月～2017年12月间门诊或住院患者80例，所有胃癌组织标本均经手术切除并经病理学证实，包括男49例，女31例，年龄37～82岁。同时随机选取浅表性胃炎患者组织标本30例，包括男14例，女16例，年龄27～71岁;随机选取萎缩性胃炎患者组织标本30例，包括男14例，女16例，年龄33～73岁。二者组织标本均取自胃镜活检并经病理学证实。本次研究所选取的患者病理组织标本均保存完好并具有完善的临床资料。

1.2主要试剂

Lgr5蛋白抗体试剂，购自英国Abcam公司，克隆号：ab75732，工作浓度：1∶100;β-catenin蛋白抗体试剂，购自北京中杉金桥生物技术有限公司，克隆号：UMAB 15，工作浓度：1∶100。

1.3 方法

1.3.1 检测方法  利用免疫组化染色SP法对Lgr5和β-catenin蛋白的表达进行检测，阳性对照选取已知阳性的切片，阴性对照选取每种抗体的Tris作为一抗的代替。本研究的所有免疫组化方法均按照说明书步骤严格进行。

1.3.2 判定方法  ①Lgr5结果判定：主要通过参照Fromo-witz综合计分法[7]进行双盲半定量观察分析，整个结果判断过程由2位工作经验丰富的病理科医师进行判读，Lgr5的主要阳性着色部位位于细胞膜及细胞质，呈浅黄色、棕黄色及深褐色颗粒。随机在400倍高倍显微镜下选取5个视野并在每个视野中计数200个细胞，通过观察细胞的着色情况进行计分[8，9]：基本不着色为0分，浅黄计为1分、棕黄色计为2分、深褐色计为3分。同时计算着色细胞占总计数细胞的百分比，根据着色细胞占比情况进行计分：无阳性细胞计0分，1%～25%计1分，26%～49%计2分，≥50%计3分。最后计算总积分，将二者所得计分相加：0～1分计为阴性（-），2分及以上计为阳性（+），当二者观察结果相差大于10%提示差异过大，则需2位病理科医师对标本情况进行重新评定。②β-catenin结果判定：正常胃黏膜上皮细胞β-catenin蛋白主要定位于细胞膜及细胞间质，表达阳性时多呈黄色，而细胞核和细胞质中β-catenin的表达多为阴性。胃癌肿瘤细胞中细胞膜上β-catenin的表达呈明显减弱或消失，同时胞质胞核出现异常染色或完全阴性染色。本研究中以细胞质和/或细胞核中的黄色颗粒作为β-catenin表达的阳性判断标准。随机在400倍高倍显微镜下选取5个视野并在每个视野中计数200个细胞，通过观察细胞的着色情况进行计分[10-11]：无黄色：0分;淡黄色：1分;棕黄色：2分;棕褐色：3分。根据着色细胞占比情况进行计分：阳性细胞<10%为0 分; 10%～50%为1分;51%～75%为2分;>75%为3分。每张切片的染色总分值为二者乘积，0分计为阴性，计为“-”;总分值1分及以上为阳性，计为“+”，当二者观察结果相差大于10%提示差异过大，则需两位病理科医师对标本情况进行重新评定。

1.4 统计学方法

本次研究采用SPSS17.0统计软件分析实验结果数据，计数资料采用χ2检验或Fisher确切概率法;采用列联系数分析Lgr5和β-catenin蛋白在胃癌组织中表达的关系。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组Lgr5和β-catenin的表达比较

2.2不同病理特征的胃癌患者Lgr5和β-catenin的表达比较

Lgr5蛋白在胃癌中的表达与患者的组织分化程度及肿瘤TNM分期存在明显相关性（P均<0.05）;β-catenin蛋白在胃癌中的表达与患者是否存在淋巴结转移以及患者的肿瘤TNM分期存在明显相关性（P均<0.05）。同时，本次研究发现Lgr5和β-catenin均与患者的年龄、性别、肿瘤浸润深度等无明显相关性（P均>0.05）。见表2。

2.3 胃癌中Lgr5和β-catenin表达的关系

3 讨论

胃癌是一种十分常见的恶性肿瘤，同时是全世界癌症死亡最常见的原因之一，在亚洲地区发病率较高[12]。与许多其他类型的癌症相同，多种遗传和分子因素可以影响胃癌的发生和进展过程，主要包括多种癌基因的激活和抑癌基因的抑制。胃癌早期无明显临床症状，患者就诊后往往提示胃癌晚期，后期疗效及预后不佳。对于可切除的胃癌患者，手术和辅助放化疗是治疗的主要途径，然而，尽管接受了标准的治疗，许多胃癌患者仍有复发和转移。目前普遍认为CSCs起源于正常的干细胞或祖细胞[13]，被认为是胃癌复发、转移和治疗失败的重要原因，许多研究发现CSCs可能在肿瘤复发和转移中发挥关键作用，CSCs相关的特异性标志物可能是靶向治疗和预后预测的关键[14]。Wnt/β-catenin信号通路是生物体内重要的信号通路之一，在人体的多种生理活动方面发挥重要的调控作用，通过调节细胞的增殖、分化、凋亡、迁移和细胞极性等控制胚胎发生过程和调控人体稳态[15]。在大量的散发性肿瘤中均发现了Wnt/β-catenin信号通路的活化突变，包括乳腺癌、白血病和胃肠道癌等，Wnt/β-catenin信号通路对促进CSCs的自我更新和诱导肿瘤细胞上皮细胞-间充质转化（EMT）具有重要的意义，其异常激活可以促进多种肿瘤的转移与进展，与胃癌肿瘤细胞的增殖和细胞凋亡减少有关[16-18]。因此，作为Wnt/β-catenin信号通路不可或缺的重要组成部分，Lgr5和β-catenin在胃癌的发生发展、靶向治疗和预后预测方面意义重大。

Lgr5，又名GPR49，在人体内分布广泛，是G-蛋白偶联受体（GPCR）家族的成员之一，研究指出Lgr5是Wnt/β-catenin信号通路的重要组成部分之一，在包括食管腺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、卵巢癌的多种人类肿瘤中均发现异常表达[19]。目前普遍认为Lgr5是胃肠道恶性肿瘤中的干细胞标志物之一[20]，作为Wnt通路的重要组成部分在启动肿瘤生长和推动远处转移中起着重要作用[21]。在人类染色体上，Lgr5 基因定位于12号染色体的q22～23处，由21个内含子和22个外显子组成[22]。Lgr5蛋白一共包括907个氨基酸分子，另一方面，Lgr5蛋白具有一处特征性的外功能区域，该区域含有17个富含亮氨酸的重复序列。Lgr5在正常人类组织中只在成人干细胞的细胞表面呈低水平表达[23]，多位于隐窝基底部，在胃肠上皮化生病变中和胃癌中Lgr5阳性表达显著上调[24]，并且与幽门螺旋杆菌感染和EMT密切相关[25-26]。目前Lgr5+细胞已经被证明具有肿瘤启动细胞或CSCs的特性，在胃癌的发生和进展过程中保留了自我更新的能力[27]。有報道指出[28]，通过杀死胃癌组织中的Lgr5阳性细胞，在体外和体内可以几乎完全抑制胃癌细胞的增殖。Gong等[29]发现使用Lgr5靶向抗体药物偶联物（antibody-drug conjugate，ADC）可以有效地根除胃肠道癌细胞并抑制体内肿瘤的生长和复发，同时可以有效的治疗胃肠肿瘤并消除胃癌CSCs。因此，Lgr5是一个新的靶点，Lgr5的拮抗剂或人类Lgr5的单克隆抗体可能在临床上适用于胃癌侵袭和转移的预防和治疗，基于Lgr5的靶向治疗可能是胃癌诊疗和改善患者预后的重要途径。本研究结果显示Lgr5蛋白在浅表性胃炎、萎缩性胃炎及胃癌中的表达逐次升高，三者之间存在显著差异（χ2=12.937，P<0.05）。Lgr5的阳性表达与患者的TNM分期及组织分化程度存在明显相关性（P均<0.05）。目前的研究对Lgr5蛋白在Wnt/β-catenin信号转导、胃癌CSCs的增殖分化以及胃癌的发生和进展过程中的具体作用机制仍然尚未完全明确，仍然需要未来进一步的研究。

β-catenin是連环素家族的一员，在多种生理活动中发挥重要的作用，是Wnt/β-catenin信号转导途径的核心组件，目前普遍的研究指出其表达上调可以诱导Wnt靶基因激活，从而促进肿瘤的发生和进展[30]。β-catenin蛋白在正常人类组织中主要定位于细胞膜，也有一部分β-catenin蛋白可见于细胞间质，主要通过结合细胞膜上的E-钙黏蛋白维持人体正常的生理功能，其中一小部分的β-catenin在细胞质内发生磷酸化并最终在蛋白酶体的作用下逐渐降解[31]。而在多种人类肿瘤中，β-catenin蛋白可出现异常表达，通常表现为在细胞膜处β-catenin表达呈现明显减弱和（或）缺失的趋势，同时在细胞质、细胞核等处的表达较前显著增强[32]。众所周知，β-catenin核积累是Wnt信号通路转录激活的关键性标志，此时异常激活的Wnt相关蛋白与多种细胞表面受体结合，进而导致糖原合成酶激酶（glycogen synthase kinase，GSK）-3β的生物活性受到抑制，使得β-catenin向核内移位，细胞核中不断积累的β-catenin蛋白最终与下游因子结合并激活Wnt/β-catenin信号通路下游相关靶基因，最终导致多种人类肿瘤的发生及进展[33]。同时有报道指出，通过增加β-catenin的降解可以显著抑制EMT过程，减少胃癌细胞在体外的迁移和侵袭以及体内的转移潜能，有效改善胃癌患者预后[34]。另一方面，Xi等[35]的研究发现，当使用小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）沉默胃癌细胞中Lgr5的表达后，β-catenin的表达出现显著降低，表明针对Lgr5的沉默和干扰可能会影响Wnt/β-catenin信号通路的激活，从而降低β-catenin进入细胞核的积累和易位，并可能最终抑制胃癌的侵袭，提示二者之间具备相关性。因此，对于评价胃癌生物学行为，β-catenin可以作为较好的指标并为胃癌的诊疗提供新的思路。本研究结果显示β-catenin蛋白的异常表达在浅表性胃炎组和萎缩性胃炎组以及胃癌组中的表达逐次升高，三者之间存在显著差异（χ2=13.654，P<0.05）。β-catenin蛋白在胃癌中的表达与患者是否存在淋巴结转移以及患者的肿瘤TNM分期存在明显相关性（P均<0.05）。因此，β-catenin是人类胃癌发生和侵袭转移的重要原因之一，进一步研究β-catenin的功能和调控机制是必要的，这将有助于更好地理解胃癌的发生和侵袭转移，有助于阐明胃癌治疗的新策略。

此外，本次研究结果还显示，作为Wnt /β-catenin信号通路的关键靶基因和组成部分，Lgr5和β-catenin之间关系密切，在胃癌中的表达呈明显相关性，推测在胃癌的发生发展过程中Lgr5和β-catenin可能具有协同作用。近年来，肿瘤治疗中一个主要的难题在于需要瞄准并消灭肿瘤，同时最小化对正常组织的不希望的毒性和损伤。因此，寻找可靠、敏感的肿瘤标志物和靶点对于胃癌的诊疗和预后极为重要。

综上所述，本次研究指出了Lgr5和β-catenin作为靶向胃癌CSCs和抑制肿瘤生长复发的治疗靶点的巨大潜力，有望为未来胃癌诊疗方法的开发提供新的方向。

[参考文献]

[1] Fang ZL，Deng J，Zhang L，et al. TRIM24 promotes the aggression of gastric cancer via the Wnt/β-catenin signaling pathway[J]. Oncol Lett，2017，13（3）：1797-1806.

[2] 杜华，师迎旭.胃癌干细胞表面标记物的研究与最新进展[J].中国组织工程研究，2016，20（41）：6225-6232.

[3] Barat S，Chen X，Bui KC，et al. Gamma-secretase inhibitor IX（GSI）impairs concomitant activation of notch and Wnt-Beta-catenin pathways in CD441 gastric cancer stem cells[J]. Stem Cell Transl Med，2017，6（3）：819-829.

[4] Clevers H，Nusse R. Wnt/beta-catenin signaling and disease[J]. Cell，2012，149（6）： 1192-1205.

[5] Alizadeh-Navaei R，Rafiei A，Abedian-Kenari S，et al. Comparison of leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 5 expression in different cancer and normal cell lines[J]. Biomed Rep，2016，5（1）：130-132.

[6] Li HL，Liang S，Cui SJ，et al. Targeting of GSK-3β by miR-214 to facilitate gastric cancer cell proliferation and decrease of cell apoptosis[J]. Eur Rev Med Pharmaco，2018，22（1）：127-134.

[7] Fromowitz FB，Viola MV，Chao S，et al. Ras p21 expression in the progression of breast cancer[J]. Hum Pathol，1987，18（12）：1268-1275.

[8] Zheng ZX，Sun Y，Bu ZD，et al. Intestinal stem cell marker LGR5 expression during gastric carcinogenesis[J]. World J Gastroentero，2013，19（46）8714-8723.

[9] Sobin L，Gospodarowicz M，Wittekind C.TNM classification of malignant tumors. UICC international union Against cancer[M]. 7th ed. New York：Wiley-Liss，2010：117-226.

[10] Wang J，Wang XY，Gong W，et al. Increased expression of beta-catenin， phosphorylated glycogen synthase kinase 3beta，cyclin D1， and c-myc in laterally spreading colorectal tumors[J]. J Histochem Cytochem，2009，57（4）：363-371.

[11] Qiao Q，Ramadani M，Gansauge S，et al. Reduced membranous and ectopic cytoplasmic expression of beta-catenin correlate with cyclin D1 overexpression and poor prognosis in pancreatic cancer[J]. Int J Cancer，2001，95（3）：194-197.

[12] Ajani JA，Bentrem DJ，Besh S，et al. National comprehensive cancer network. gastric cancer version 2.2013：Featured updates to the NCCN Guidelines[J]. J Natl Compr Canc Netw，2013，11（5）：531-546.

[13] Hayakawa Y，Fox JG，Wang TC. The origins of gastric cancer from gastric stem cells： Lessons from mouse models[J]. Cell Mol Gastroentero Hepatology，2017，3（3）：331-338.

[14] Chen XL，Chen XZ，Wang YG，et al. Clinical significance of putative markers of cancer stem cells in gastric cancer： A retrospective cohort study[J]. Oncotarget，2016，7（38）：62049-62069.

[15] 李月雅，李凱. Wnt/β-catenin信号通路对肿瘤干细胞作用的研究进展[J].山东医药，2016，56（9）：98-100.

[16] Huang HT，Chen ZQ，Ni XQ. Tissue transglutaminase-1 promotes stemness and chemoresistance in gastric cancer cells by regulating Wnt/bcatenin signaling[J]. Exp Biol Med，2017，242（2）：194-202.

[17] Zhan T，Rindtorff N，Boutros M. Wnt signaling in cancer[J].Oncogene，2017，36（11）：1461-1473.

[18] 李国栋，王洋洋，刘玉河，等.EPHA2通过增强Akt/mTOR信号通路促进SGC-7901细胞的增殖[J].中国癌症杂志，2016，26（2）：128-133.

[19] Xi HQ，Zhang KC，Li JY，et al. RNAi-mediated inhibition of Lgr5 leads to decreased angiogenesis in gastric cancer[J]. Oncotarget，2017，8（19）：31581-31591.

[20] 刘元华，樊祥山，恽艳.应用组织芯片技术检测胃癌组织中Lgr5和CD44的表达[J].中国肿瘤外科杂志，2015， 7（6）：341-345.

[21] Li XB，Yang G，Zhu L，et al. Gastric Lgr5（+）stem cells are the cellular origin of invasive intestinal-type gastric cancer in mice[J]. Cell Res，2016，26（7）：838-849.

[22] 周小嫔，王佐妤，谢立群.Lgr5与胃癌关系的研究进展[J].胃肠病学和肝病学杂志，2015，24（2）：226-228.

[23] Munoz J，Stange DE，Schepers AG，et al. The Lgr5 intestinal stem cell signature：Robust expression of proposed quiescent '+4' cell markers[J]. Embo J，2012，31（14）：3079-3091.

[24] Jang BG，Lee BL，Kim WH. Distribution of Lgr5+ cells and associated implications during the early stage of gastric tumorigenesis[J]. PloS one，2013，8（12）：82390-82403.

[25] Wang B，Chen QT，Cao Y，et al. LGR5 is a gastric cancer stem cell marker associated with stemness and the EMT signature genes NANOG，NANOGP8，PRRX1，TWIST1， and BMI1[J]. PloS one，2016，11（12）：1-21.

[26] Chang TS，Wei KL，Lu CK，et al. Inhibition of CCAR1，a coactivator of β-catenin，suppresses the proliferation and migration of gastric cancer cells[J]. Int J Mol Sci，2017， 18（2）：460-474.

[27] Han Y，Xue X，Jiang M，et al. LGR5，a relevant marker of cancer stem cells，indicates a poor prognosis in colorectal cancer patients：A meta-analysis[J]. Clin Res Hepatol Gastroenterol，2015，39（2）：267-273.

[28] Wang ZL，Liu C. Lgr5-positive cells are cancer-stem-celllike cells in gastric cancer[J]. Cell Physiol Biochem，2015，36（6）：2447-2455.

[29] Gong X，Azhdarinia A，Ghosh SC，et al. Lgr5-targeted antibody-drug conjugate eradicates gastrointestinal tumors and prevents recurrence[J]. Mol Cancer Ther，2016， 15（7）：1580-1590.

[30] Kidani T，Nakamura A，Kamei S，et al. Overexpression of cytoplasmic β-catenin inhibits the metastasis of the murine osteosarcoma cell line LM8[J]. Cancer Cell Int，2014，14（1）：31-40.

[31] Liu NN，Zhou N，Chai N，et al. Helicobacter pylori promotes angiogenesis depending on Wnt/beta-catenin-mediated vascular endothelial growth factor via the cyclooxygenase-2 pathway in gastric cancer[J]. Bmc Cancer，2016，16（1）：321-332.

[32] Lee SY，Saito T，Mitomi H，et al. Mutation spectrum in the Wnt/β-catenin signaling pathway in gastric fundic gland-associated neoplasms/polyps[J]. Virchows Arch，2015，467（1）：27-38.

[33] Tang XL，Zheng D，Hu P，et al. Glycogen synthase kinase 3 beta inhibits microRNA-183-96-182 cluster via the b-catenin/TCF/ LEF-1 pathway in gastric cancer cells[J].Nucleic Acids Res，2014，42（5）：2988-2998.

[34] Ye JX，Jie Xu J，Li Y，et al. DDAH1 mediates gastric cancer cell invasion and metastasis via Wnt/b-catenin signaling pathway[J]. Mol Oncol，2017，11（9）：1208-1224.

[35] Xi HQ，Cai AZ，Wu XS，et al. Leucine-rich repeat-containing G-proteincoupled receptor 5 is associated with invasion，metastasis，and could be a potential therapeutic target in human gastric cancer[J]. Brit J Cancer，2014， 110（8）：2011-2020.

（收稿日期：2018-09-21）