超声辅助热水提取-离子色谱法 同时测定蔬菜中的硫氰酸盐和高氯酸盐

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(宁波市食品检验检测研究院,浙江宁波 315048)

硫氰酸盐又称硫氰化物,包括硫氰酸钠、硫氰酸钾、硫氰酸铵等,属于高环境风险产品。人体若过量摄入硫氰酸盐,其在体内会释放氰根离子,引起人体急性毒性,从而表现出恶心、呕吐、昏迷、器官功能衰竭等症状;硫氰酸盐的慢性毒性主要是抑制碘的转运和甲状腺激素合成,引发甲状腺疾病,影响胎儿和婴幼儿大脑和神经系统的正常发育[1]。研究表明,许多植物,尤其是十字花科类植物,含有大量的硫代葡萄糖甙(硫甙),硫甙在硫葡萄糖甙酶作用下可降解为硫氰酸盐[2]。目前,关于单体硫氰酸盐对生物体毒性研究较多[3-4],但富含硫氰酸盐植物对生物体影响的报道较少[5-6],硫氰酸盐的检测方法研究集中在乳制品测定中,主要包括分光光度法、电位滴定法、毛细管电泳法和离子色谱法[7-12]等,至于蔬菜中硫氰酸盐的检测方法至今还未有任何报道。

高氯酸盐是指高氯酸形成的盐类,广泛存在于自然界中,主要用作火箭燃料和烟火中的氧化剂和安全气囊中的爆炸物,由于其水溶性、流动性强,具有高度的扩散性和持久性,易导致对水源、土壤等环境的长期污染,经植物吸收富集后,可通过食物链进入人体[13-14]。高氯酸盐是一种持久性的有毒化学物质,能被甲状腺吸收,减少甲状腺对碘的吸收,干扰人体甲状腺的正常功能,从而影响大脑组织的发育,对胚胎、婴幼儿和少年儿童的发育危害巨大[15]。目前已有关于水、土壤、乳制品、茶叶等中高氯酸盐含量的相关报道[16-25],较少有蔬菜中的相关研究报道[26]。

目前,我国还没有蔬菜中硫氰酸盐和高氯酸盐检测的国家标准或行业标准,也没有蔬菜中硫氰酸盐和高氯酸盐的限值规定以及蔬菜中硫氰酸盐和高氯酸盐对人体健康的潜在风险评估(尤其对于存在甲状腺疾病的人群)。因此发展一种蔬菜中快速、高效、准确的硫氰酸盐和高氯酸盐检测方法,对我国蔬菜中硫氰酸盐和高氯酸盐的正常生理浓度作全面普查,并在此基础上制定不同类蔬菜中合理的限量标准具有重要意义。但是,目前氰酸盐和高氯酸盐的测定方法中,样品前处理方法均较为复杂,前处理时间长,操作繁琐。如离子色谱法测定乳制品中硫氰酸盐含量前处理多为溶剂提取+固相萃取(SPE)柱净化模式,由于乳粉样品含有大量蛋白质和脂肪等物质,影响色谱柱的寿命,因而在提取后必须采用乙腈、乙酸等有机溶剂去除样品中的蛋白质,过RP固相萃取柱去除样品中的脂肪后再进行测定[7-10];离子交换高效液相色谱-串联质谱法测定鸡肉和鸡肝中的高氯酸盐,前处理采用乙酸溶液-乙腈提取,固相萃取柱净化再进行测定[27]。

本文建立了以超声辅助超纯水提取,离心后直接过膜进样分析的前处理技术和超强亲水性色谱柱分离、中等浓度氢氧化钾淋洗液洗脱的特定离子色谱条件下,同时测定蔬菜中硫氰酸盐和高氯酸盐的方法,以期为我国蔬菜中硫氰酸盐和高氯酸盐检测的国家标准或行业标准的建立提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜蔬菜(西蓝花、五号菜、菠菜、青菜、包心菜、大白菜)和蔬菜干制品(万年青、萝卜干) 购于宁波市清水桥菜市场;KOH淋洗液 色谱纯,美国戴安公司;超纯水 实验室自制;1000 mg/L硫氰酸盐(SCN)标准品 美国o2si smart solutions公司;1000 mg/L高氯酸盐(ClO4) 美国Inorganic Ventures公司。

AQUION离子色谱仪 美国戴安公司,配有淋洗液自动发生装置、电导检测器、抑制器;Milli-Q Reference超纯水仪 美国MILLIPORE公司;KS300EI超声波清洗器 宁波海曙科生超声设备有限公司;TGL-20M高速台式冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;ME204E电子天平 瑞士METTLER TOLEDO公司;JYL-C16V九阳料理机 九阳股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理 将不同种类的新鲜蔬菜和蔬菜干制品采用九阳料理机精磨粉碎,分别取鲜样10 g、干样2 g于50 mL刻度离心管中,加超纯水至20 mL,室温下超声(功率300 W)提取20 min,然后将获得的超声提取液在8000 r/min下离心5 min,上清液过0.22 μm滤膜,上机待测[10,24]。

1.2.2 色谱条件 色谱柱:IonPac AS16分析柱,IonPac AG16保护柱;抑制器:ASRS-500e型抑制器,4 mm,外加水抑制模式;抑制电流:161 mA;柱温:30 ℃;淋洗液:KOH溶液,梯度洗脱;淋洗液流速:1.0 mL/min;进样体积:100 μL;梯度洗脱条件见表1[10,25]。

表1 色谱柱梯度淋洗条件Table 1 The gradient elution conditions in the chromatographic column

1.2.3 标准曲线的绘制与检出限 将硫氰酸盐和高氯酸盐标准品用超纯水稀释,分别配制成0.2、0.5、1、2、5 mg/L和0.04、0.1、0.2、0.4、1 mg/L的混合标准溶液,在1.2.2 色谱条件下,将不同浓度的标准溶液依次进样分析,测定相应的色谱峰面积值,以硫氰酸盐和高氯酸盐的质量浓度为横坐标,色谱峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,得到硫氰酸盐和高氯酸盐的线性方程及相关系数,以信噪比S/N=3计算其检出限。

1.2.4 方法回收率及重复性实验 取6份包心菜样品按1.2.1 样品前处理和1.2.2色谱条件下测定硫氰酸盐和高氯酸盐含量,计算其相对标准偏差。

分别向包心菜样品加入低、中、高3种不同浓度的硫氰酸盐和高氯酸盐标准溶液,充分混匀,按1.2.1 样品前处理和1.2.2色谱条件下进行测定,计算样品加标回收率。

1.2.5 实际样品的测定 采用1.2.1 样品前处理和1.2.2色谱条件下对市售8类蔬菜样品进行测定,计算其硫氰酸盐和高氯酸盐的含量。

1.3 数据处理

采用Excel 2010和SPSS 16.0数据统计软件处理分析试验数据。

2 结果与讨论

2.1 淋洗液和色谱柱的选择

阴离子交换色谱中,淋洗液一般为碳酸根和氢氧根,亲脂性季铵烷功能基色谱柱比较适合于碳酸根淋洗液,亲水性季铵烷醇功能基色谱柱则比较适合于氢氧根淋洗液,硫氰酸根和高氯酸根离子属于高价、易极化和疏水性的阴离子,对固定相有较强的亲和力,在普通的阴离子色谱柱上保留时间长,色谱峰较宽且拖尾,甚至不被洗脱,因此需要选择亲水性色谱柱。美国戴安公司常用的亲水性色谱柱中,IonPac AS16阴离子色谱柱为超强亲水性色谱柱,且其固定相上键合强亲水性烷醇基季铵盐对氢氧根的亲和力较强,使用中等浓度的氢氧根淋洗液即可达到易极化阴离子的快速分离,并且峰型尖锐对称[28]。因此,选用的淋洗液为KOH溶液,色谱柱为IonPac AS16阴离子色谱柱。

2.2 标准曲线与检出限

以硫氰酸盐和高氯酸盐质量浓度为横坐标,色谱峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,标准溶液色谱图如图1所示,得到硫氰酸盐在0.2～5.0 mg/L线性范围内的线性方程为Y=1.6637X-0.0876,相关系数r=0.9997,高氯酸盐在0.04～1.00 mg/L线性范围内的线性方程为Y=0.8629X-0.0036,相关系数r=0.9989,表明两种物质的峰面积与质量浓度的线性相关性良好;以信噪比S/N=3计算检出限,硫氰酸盐和高氯酸盐的检出限分别为0.005、0.008 mg/L。

图1 硫氰酸盐和高氯酸盐标准溶液色谱图Fig.1 Chromatogram of thiocyanate and perchlorate standard solution注:峰1：硫氰酸盐；峰2；高氯酸盐。

2.3 方法回收率及重复性实验

样品中硫氰酸盐和高氯酸盐的离子色谱图见图2,计算结果的相对标准偏差和平均加标回收率分别见表2和表3。由表2和表3可知,硫氰酸盐和高氯酸盐相对标准偏差分别为1.6%和6.9%,表明该方法重复性较好;硫氰酸盐和高氯酸盐的平均加标回收率分别在89.9%～98.4%之间和81.2%～94.4%之间,表明该方法准确度较高。

图2 样品中硫氰酸盐和高氯酸盐色谱图Fig.2 Chromatograms of thiocyanate and perchloratein in the sample注:峰1：硫氰酸盐；峰2；高氯酸盐。

表2 包心菜样品中硫氰酸盐 和高氯酸盐含量及精密度(n=6)Table 2 Thiocyanate and perchlorate content and precision(RSD)in the cabbage samples(n=6)

表3 包心菜样品中硫氰酸盐 和高氯酸盐的平均加标回收率(n=6)Table 3 Standard addition recoveries of thiocyanate and perchlorate in the cabbage samples(n=6)

2.4 实际样品测定

采用本方法对8类蔬菜样品进行检测。由表4可知,检测样品中均含有一定量的硫氰酸盐和高氯酸盐,含量分别在2.869～32.35和0.057～1.417 mg/kg范围内,其中萝卜干含量最高,干制蔬菜的硫氰酸盐和高氯酸盐含量明显高于新鲜蔬菜,这可能是由于新鲜蔬菜含水量较高的缘故。

表4 样品中硫氰酸盐和高氯酸盐含量(n=3)Table 4 Thiocyanate and perchlorate content in the samples(n=3)

由于人体每天对蔬菜的摄入量较大,《中国居民膳食指南》推荐正常成年人每人每天蔬菜摄入量为300～500 g,世界卫生组织推荐标准为每人每天摄入量不应少于400 g。目前,我国还没有蔬菜中正常生理浓度的硫氰酸盐和高氯酸盐限值规定,欧洲食品安全局(EFSA)设定高氯酸盐的每日容许摄入量(TDI)为0.3 μg/kg体质量,如果以60 kg正常成年人每天摄入蔬菜量400 g计算,6类新鲜蔬菜高氯酸盐平均含量为0.098 mg/kg,高氯酸盐的摄入量为 0.65 μg/kg体质量,已超过了EFSA设定的限值。由于本实验所选的8类蔬菜无法完全代表居民正常的每天蔬菜摄入量,同时蔬菜中还含有较高的硫氰酸盐,因此蔬菜中的硫氰酸盐和高氯酸盐对人体健康风险需要更深入的研究和评估。

3 结论

本文建立了同时分析蔬菜中硫氰酸盐和高氯酸盐的检测方法,重点简化了以超声辅助超纯水提取、离心后直接过膜分析的前处理技术以及采用超强亲水性色谱柱分离、中等浓度氢氧化钾淋洗液洗脱的快速分离技术,本方法硫氰酸盐和高氯酸盐分别在0.2～5.0和0.04～1.00 mg/L范围内具有良好的线性关系,相关系数分别为0.9997和0.9989,检出限分别为0.005、0.008 mg/L,方法回收率分别为89.9%～98.4%和81.2%～94.4%,分析方法准确可靠、灵敏度高,可满足同时测定蔬菜中硫氰酸盐和高氯酸盐的检测要求。