两种魔芋多糖抗疲劳及降血糖活性

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(陕西科技大学食品与生物工程学院,陕西西安 710021)

魔芋(Konjac)为天南星科多年生草本植物的块茎,主要产于陕西、四川、云南[1]等地。魔芋加工成精粉后所得的主要成分是魔芋多糖(Konjac glucomannan,KGM)[2]。KGM又称魔芋葡苷露聚糖,它是一种水溶性的、高分子量的多糖，而将KGM通过酶解法、酸解法、辐照法等方法降解后可得到魔芋低聚糖(Konjac glucomannan oligosaccharide,KOGM)。

研究表明,KGM具有多种独特的理化性质,如吸水性、流变性[3]、增稠性[4]和成膜性[5]等。同时,KGM还具有良好的降脂、降血糖、减肥、润肠通便、抗肿瘤和抗氧化能力[6-7]等生理活性。而KOGM和KGM同样具有降血脂、减肥等生理活性,此外,KOGM还具有促进益生菌生长、调节免疫等功效[2]。

目前,关于魔芋多糖的研究主要集中在其性质和生物学方面[3,7],但是鲜见关于KGM及KOGM的抗疲劳及其糖耐量作用的研究报道。因此本实验通过构建小鼠游泳疲劳模型,研究了KGM及KOGM的抗疲劳活性,同时通过口服葡萄糖糖耐量实验,研究KGM及KOGM对正常小鼠糖耐量的改善作用,为KGM及KOGM作为药物的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验动物为SPF级昆明种小鼠 雄性,体重20～22 g,西安交通大学医学院实验动物中心,许可证号:SYXK2012(陕)2012-006;KGM及KOGM 纯度≥95.0%,四川西亚化工股份有限公司;邻苯三酚、三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)和其余化学试剂 均为国产分析纯。

HH-2数显恒温水浴锅 国华电器有限公司;752型紫外分光光度计 上海光谱仪器有限公司;7230G可见分光光度计、TDL-40B电子天平 上海精密科学仪器有限公司;TGL-16C高速离心机 上海安亭仪器厂;85-1磁力加热搅拌器 国华电器有限公司;罗康全活力型血糖试纸、Accu-Chek Aticve血糖仪 Roche Diagnostics Gmbh。

1.2 抗疲劳实验

1.2.1 力竭游泳实验 取35只SPF级小鼠,适应性喂养3 d后,随机分为空白对照组,KGM高剂量组(60 mg/kg)、中剂量组(30 mg/kg)、低剂量组(15 mg/kg)及KOGM高剂量组(60 mg/kg)、中剂量组(30 mg/kg)、低剂量组(15 mg/kg)共7组,每组5只。空白对照组给予等体积生理盐水,其余各组按照不同给药浓度,每天给药1次,连续给药6 d。末次给药30 min后,称量小鼠体重,之后将小鼠放入(70 cm×50 cm×40 cm,水深为30 cm,水温保持在25±0.5 ℃)游泳箱中游泳,每只小鼠尾部附着其体重5%的铅丝。从小鼠入水开始计时,直至其体力耗尽(判断标准:小鼠头部沉入水中5 s内不能浮出水面),记录各组小鼠的力竭游泳时间。力竭游泳后,待各组小鼠恢复1 h,取小鼠肝脏经生理盐水清洗并于-20 ℃冰箱冷冻保存,之后在4 ℃下进行匀浆。

1.2.2 超氧化物歧化酶(SOD)活力的测定 采用邻苯三酚自氧化法[8]测定组织中SOD含量。取20 μL肝脏组织匀浆,加入3 mL pH8.2的磷酸缓冲液及50 mmol/L邻苯三酚,摇匀后立即于325 nm下测定反应体系的吸收值,且每隔30 s记录一次,反应3 min。肝脏样品SOD的比活力以下式1,2计算。

单位体积活力(U/mL)=[0.07-1/3(At-A0)]/(0.07×0.02)

式(1)

样品SOD比活力(U/mg·Pro)=单位体积活力/Cpr(U/mg·Pro)

式(2)

式中,At-3 min时样品溶液的吸光值;A0-0时刻样品溶液的吸光值;Cpr-样品蛋白质含量(mg/mL)。

1.2.3 丙二醛(MDA)含量的测定 采用TBA比色法[8]测定肝脏组织中脂质过氧化的程度,取0.3 mL肝脏组织匀浆,加入TCA-TBA-HCl溶液1.0 mL,静置10 min后,沸水浴反应30 min,流水彻底冷却,再加入5 mL正丁醇萃取反应产物MDA,4000 r/min离心10 min取上清液于532 nm下测量吸收值。

样品MDA含量(nmol/mg·Pro)=(AMDA×5/ε)/(0.3×Cpr)×106

式(3)

式中,AMDA-样品溶液的吸光值;ε-脂质过氧化物摩尔消光系数1.56×105(L·cm-1·mol-1);Cpr-样品蛋白质含量(mg/mL)。

1.3 糖耐量试验

取40只SPF级小鼠,适应性喂养3 d后,随机分为空白对照组,阳性对照组,KGM高剂量组(60 mg/kg)、中剂量组(30 mg/kg)、低剂量组(15 mg/kg)及KOGM高剂量组(60 mg/kg)、中剂量组(30 mg/kg)、低剂量组(15 mg/kg)共8组,每组5只,空白对照组灌胃等量生理盐水,阳性对照组给与盐酸二甲双胍(110.5 mg/kg),每日灌胃1次,连续灌胃6 d,第6 d给药后禁食不禁水12 h,第7 d各组小鼠灌胃葡萄糖水溶液(150 mg/mL),尾静脉取血,用血糖仪检测0、30、60、120 min的血糖水平,进行口服葡萄糖糖耐量实验[9-10]。

1.4 统计学分析

2 结果与分析

2.1 抗疲劳实验结果

2.1.1 KGM和KOGM对小鼠力竭游泳时间的影响 疲劳是指机体生理功能不能维持在特定的水平,或不能维持预期的运动负荷强度,从而导致工作能力和工作效率下降,属于一种复杂的生理变化过程[11-13]。力竭游泳测试是最常用的抗疲劳测试方法,而力竭游泳时间则是反映运动耐力最重要的指标,可以最直接地体现出所研究药物的抗疲劳功效[14-15]。KGM及KOGM对小鼠力竭游泳时间的影响如图1、图2所示,与空白对照组相比,KGM和KOGM可以在一定程度上延长小鼠负重游泳时间,其中KGM高剂量组可以极显著延长小鼠负重游泳时间(p<0.01),KGM中剂量组、低剂量组以及KOGM高剂量组能够显著延长小鼠负重游泳时间(p<0.05),说明KGM和KOGM对小鼠具有一定程度的抗疲劳效果。同时,不同剂量的KGM和KOGM对小鼠的抗疲劳效果也有所不同,高剂量具有最佳效果。结果表明,KGM具有抗疲劳作用。

图1 KGM组小鼠游泳时间Fig.1 Swimming time of KGM group in mice

图2 KOGM组小鼠游泳时间Fig.2 Swimming time of KOGM group in mice

2.1.2 KGM和KOGM对运动后小鼠肝脏中SOD活力的影响 机体在运动,特别是大量运动时会使自由基的净生成量增多[16],自由基具有很强的氧化能力,它可以影响机体的正常生理秩序,使机体的代谢发生改变,造成机体氧化损伤[17]。SOD是清除体内自由基的关键酶,可以保护细胞免受损伤[18]。因此检测机体中的SOD活力高低可以间接地反映出机体保护受损细胞以及清除体内自由基的能力[19]。KGM和KOGM对小鼠肝脏中SOD活力的影响见图3、图4。与空白对照组相比,KGM和KOGM高剂量组中的SOD活力极显著增加(p<0.01)、中剂量组中的SOD活力显著增加(p<0.05),低剂量组与空白对照组相比没有显著性差异(p>0.05)。

图3 KGM对运动后小鼠肝脏中SOD活力的影响Fig.3 Effect of KGM on SOD activity in mice liver after exercise

图4 KOGM对运动后小鼠肝脏中SOD活力的影响Fig.4 Effect of KOGM on SOD activity in mice liver after exercise

2.1.3 KGM和KOGM对运动后小鼠肝脏中MDA含量的影响 MDA是一种脂质过氧化产物,可以改变细胞膜的通透性,引起核酸、蛋白质等生命大分子发生交联聚合,能够反映机体的损伤程度[18,20]。KGM和KOGM对小鼠力竭游泳后肝脏中的MDA含量影响结果见图5、图6,与空白对照组相比,KGM和KOGM高剂量组可显著降低小鼠细胞中的MDA(p<0.05),从而避免了小鼠剧烈运动后大量MDA的积累对细胞所造成的伤害。虽然KGM和KOGM中剂量和低剂量组也可以降低肝脏中MDA的含量,但与空白对照组相比未显示出显著性差异(p>0.05),说明KGM和KOGM对MDA含量的影响可能呈剂量依赖性。实验结果表明,与对照组相比,KGM和KOGM具有提高小鼠肝脏中SOD活力、降低MDA含量的作用,说明KGM和KOGM有抗疲劳药理作用,且以高剂量组的效果最佳,而低剂量并未发现有明显优势。

图5 KGM对运动后小鼠肝脏中MDA含量的影响Fig.5 Effect of KGM on MDA content in mice liver after exercise

图6 KOGM对运动后小鼠肝脏中MDA含量的影响Fig.6 Effect of KOGM on MDA content in mice liver after exercise

2.2 糖耐量实验结果

糖耐量是指人体对葡萄糖的耐受能力[21-22]。而糖耐量降低是二型糖尿病发展的一个中间阶段,糖耐量的恢复程度是评价药物疗效的一个重要方面[10]。在口服葡萄糖糖耐量实验中,先对小鼠的空腹血糖进行测定,之后立即灌胃葡萄糖,每隔固定时间测定小鼠血糖值。由于葡萄糖的摄入,在30 min时小鼠血糖值较摄入葡萄糖前有较大程度的提高,60 min时由于葡萄糖吸收较为完全,因此较30 min时有所下降。在120 min时较60 min时有较大程度的下降,相当于餐后的血糖值已趋于平稳,据此可以测试药物的糖耐量改善作用。

由表1可知,KGM和KOGM两种不同分子量的多糖对小鼠糖耐量的改善没有明显差异,效果几乎相同。空白组、KGM和KOGM各不同剂量组及阳性对照组小鼠血糖值均在30 min时达到峰值,60 min时有所下降,在120 min时恢复到正常血糖值。与空白对照组相比,KGM高剂量组能够显著降低给葡萄糖30 min后的小鼠血糖值(p<0.05),但给药60和120 min后的血糖值,与空白组相比无显著差别。与空白组相比,KOGM高剂量组能够降低给葡萄糖30 min后的血糖值(p<0.05)。灌胃葡萄糖30 min后,与阳性对照组相比,KOGM高剂量组具有极显著性，KGM各剂量组和KOGM、低剂量组具有显著性差异(p<0.05),在60和120 min时,与阳性对照相比,KGM各剂量组、KOGM高剂量组和中剂量组没有明显差异。说明KGM和KOGM在一定程度上能够降低小鼠血糖值,KGM的降糖效果强于KOGM,两者比阳性对照药物二甲双胍更早发挥降糖作用。

表1 KGM和KOGM对小鼠葡萄糖耐受量的影响Table 1 Effect of KGM and KOGM on glucose tolerance in mice

在本实验中,阳性二甲双胍组在30 min时的血糖值远高于两种不同分子量多糖在30 min时的血糖值,这主要是因为二甲双胍需要一定的时间来增强周围组织对胰岛素的敏感性,促进肌肉等外周胰岛素靶组织对葡萄糖的摄取和利用,从而增加葡萄糖的摄取,减少肝糖原的输出以及糖原异生,从而达到降血糖的目的[23]。而多糖可以增加小鼠的糖原储存能力,在小鼠的肝糖原水平恢复上起到了主要作用,两者的作用机制有所不同,因此在30 min时的血糖值会有较大差异。本实验研究结果表明,与空白对照组相比,KGM和KOGM两种分子量的多糖在连续服用6 d后,均具有增强机体对葡萄糖的耐受能力,尤其以高剂量组和阳性二甲双胍药物组效果最为明显。表明两种分子量的多糖可以提高机体对葡萄糖的耐受能力,且以高剂量组效果最佳。

3 结论

综上所述,KGM和KOGM可以延长小鼠力竭游泳时间,具有一定的抗疲劳作用,其中KGM的效果优于KOGM的效果,同时通过测定相关酶学指标,得出KGM和KOGM都可以提高小鼠肝脏中SOD活力,降低MDA含量。口服葡萄糖糖耐量实验表明,KGM可以改善小鼠糖耐量,具有一定的降血糖效果。但KGM和KOGM两种不同分子量的多糖降血糖方面并没有显示出明显差异。本研究结果表明,一定量的KGM和KOGM具有抗疲劳和降血糖效果,可以对糖尿病起到防治作用,同时为魔芋多糖的进一步开发和研究提供科学依据。