植物罹病组织中南方、爪哇、花生根结线虫的LAMP快速检测

吴文涛， 李梅云， 许姗姗， 薛美静， 张 靖， 魏环宇， 王 扬*

1云南农业大学植物保护学院，云南 昆明 650201； 2云南省烟草农业科学研究院，云南 昆明 650021

根结线虫Meloidogynespp.是分布最广、危害最重的植物寄生线虫，已引起世界各国的关注。其中南方根结线虫M.incognita(Kofold & White) Chitwood、花生根结线虫M.arenariaNeal和爪哇根结线虫M.javanicaTreub由于寄主植物多和分布较广的特点，成为温带、亚热带和热带地区的优势种群，也是当前中国最重要的农作物病原线虫(孟庆鹏等,2004)。由根结线虫引起的病害遍布全国大部分地区，每年给农业生产造成巨大的经济损失(刘维志，2000； 赵鸿等，2003)。根结线虫病为土传病害，显症晚，危害重，极难防治。关于根结线虫的防治，目前主要采用选育抗性品种、农业防治、物理防治、化学防治和生物防治等手段(孔祥义和陈锦才，2006； 文廷刚等，2008)。由于在作物种植中长期使用化学药剂会使作物生产的可持续发展和安全性降低，在我国大部分地区已开始限制使用化学药剂。因此，选用抗性品种以及生物防治逐渐成为主要手段。

各种根结线虫之间存在显著的致病差异，因此对病害发生区域的有效防治依赖于对根结线虫种类准确的检测和诊断。传统的根结线虫的分类鉴定主要是形态学鉴定和同工酶电泳技术(武扬等，2005)，其中，形态学鉴定方法主要依靠观察根结线虫的外部形态，包括体长、口针、尾部和会阴花纹等外部可见特征来鉴别。但是，由于许多根结线虫在外部形态上相似，要求鉴定者有丰富的经验。同工酶电泳技术虽然可以准确地鉴定根结线虫的种类，但并不适合土样当中的根结线虫的检测。反转录—环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种新的核苷酸扩增技术(Notomietal.,2000)，与传统的PCR技术相比，LAMP不需要热循环，实验结果肉眼即可观察，具有方便快捷、高效和特异性强等特点，目前已在植物线虫的检测中得到广泛应用。Kikuchietal.(2009)、Niuetal.(2012)、Pengetal.(2012)分别建立了松材线虫Bursaphelenchuhxylophilus、象耳豆根结线虫Meloidogynespp.、香蕉穿孔线虫Radopholussimilis的LAMP检测体系。也有研究表明，利用SCAR引物扩增出的多态性DNA(RAPD)片段可以鉴定根结线虫的种类，这些RAPD片段可能代表着物种特异性基因并用于LAMP检测(Niuetal.,2011)。

本研究根据3种根结线虫的SCAR特异性引物对所选择的根结线虫的DNA片段进行PCR扩增，扩增产物纯化、回收并测序。根据3种根结线虫的测序结果，针对种类特异区段，分别设计3种根结线虫的LAMP引物,并对3种根结线虫进行检测，验证引物的特异性和灵敏度，从而建立一种从罹病植物组织中检测3种根结线虫的LAMP快速检测方法，以期为田间样本的直接检测提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试线虫

南方根结线虫从云南永胜的油橄榄上采集，花生根结线虫从云南建水的烟草上采集，爪哇根结线虫从云南普文的油藤上采集，3种根结线虫由本实验室分类纯化，在温室扩繁保存。

1.2 试剂

rTaqDNA 聚合酶、dNTPs、DNA Marker(宝生物工程)；Bst DNA 聚合酶大片段(NEB公司)；SYBR GreenⅠ(Invitrogen 公司)；蛋白酶 K(Roche公司)。

1.3 线虫DNA提取

在显微镜下挑取单头供试线虫放入装有 10 μL ddH2O的0.2 mL离心管中，加入8 μL的10×PCR buffer 溶液(TaKaRa)、2 μL蛋白酶K溶液，采用冻融法反复冻融6～7次，-80 ℃下保存30 min，65 ℃温育 90 min，95 ℃反应 10 min，反应完成后，12000 r·min-1离心1 min，上清液作为线虫DNA模板直接用于LAMP和PCR反应(万新龙等，2007)。

1.4 3种根结线虫种类特异性区段扩增

分别采用3种根结线虫的SCAR特异性引物(Zijlstra & Donkers,2000),以基因组DNA为模版，对所选择的根结线虫进行PCR扩增，扩增产物纯化、回收并测序。PCR反应体系：10×Buffer(含Mg2+)5 μL，10 mmol·L-1dNTP 4 μL，引物 rDNA1 和 rDNA2(10 μmol·L-1)各 1 μL，rTaq酶(5 U·μL-1，TaKaRa)2.5 U，模板 DNA 5 μL，ddH2O补足至 50 μL。爪哇和南方根结线虫的扩增条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min，37个循环；72 ℃ 10 min。花生根结线虫的扩增条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min，37个循环；72 ℃ 10 min。

1.5 LAMP引物设计

根据3种根结线虫的测序结果，针对SCAR特异性引物扩增的种类特异区段，采用PrimerExplorerV4 软件，分别设计3种根结线虫的LAMP引物。设计的引物组人工合成后，以提取的纯化种群线虫DNA为模板，分别进行引物组的特异性测试，筛选出分别针对3种根结线虫的最佳引物组。

1.6 LAMP反应体系的建立

反应体系包括外引物F3和B3各 0.2 μmol·L-1、内引物FIP和BIP各1.6 μmol·L-1、dNTPs(1 mmol·L-1)、20 mmol·L-1Tris-HCl (pH 8.8)、10 mmol·L-1KCl、MgSO4(5.0 mmol·L-1)、10 mmol·L-1(NH4)2SO4、0.1% Triton x-100,8 U Bst DNA聚合酶大片段、1 μL DNA 模板，用灭菌双蒸馏水补全到25 μL。混合均匀后，置于60～65 ℃恒温水浴中保温45 min，82 ℃保温 5 min(魏洪岩等，2016)。

1.7 LAMP扩增产物的检测

LAMP扩增产物检测采用2种方法。(1)SYBR Green Ⅰ显色法：LAMP 反应结束后，加入 2 μL 100×SYBR Green Ⅰ，混匀后紫外照射下观察颜色变化。(2)琼脂糖凝胶电泳法：取2 μL扩增产物在 2%的琼脂糖凝胶上电泳，染色，结果在凝胶成像系统中观察。

1.8 罹病根组织的LAMP直接检测

从人工接种南方、花生和爪哇根结线虫的番茄根系分别取10个根结，将上述罹病根系的根结放入装有 17.5 μL的 10×PCR buffer的离心管中，加入7.5 μL的蛋白酶 K(600 μg·mL-1)和 25 μL无菌水，混合均匀后离心，放入液氮中速冻，用研磨棒充分捣碎，点动离心后，将离心管放入 65 ℃条件下温育 90 min，95 ℃下反应10 min，冷却至室温，12000 r·min-1离心1 min后的上清液即可作为DNA模板进行 LAMP 试验和常规 PCR 检测(何旭峰等，2013)。

2 结果与分析

2.1 3种根结线虫的特异性引物PCR及测序结果

采用SCAR特异性引物扩增获得南方根结线虫DNA序列长度为990 bp，爪哇根结线虫为720 bp，花生根结线虫为420 bp(图1)。将SCAR特异性引物扩增的3种根结线虫的特异性序列通过blast对比发现，本研究所用的南方根结线虫与已报道的南方根结线虫的SCAR标记特异区段(JN005841、KP411873)的相似性为99%,花生根结线虫与已报道的花生根结线虫的SCAR标记特异区段(KP234264)的相似性为97%，爪哇根结线虫与已报道的爪哇根结线虫的SCAR标记特异区段(KP087916)的相似性为99%。

图1 3种根结线虫的特异性扩增Fig.1 Specific amplification of the three root-knot nematodesA、B、C依次为南方、爪哇 和花生根结线虫DNA电泳图。电泳所用Marker大小为2000 bp。 A, B, C: The electrophoretograms of DNA from M. incognita, M. javanica, and M. arenaria. The size of the Marker used was 2000 bp.

2.2 3种根结线虫的LAMP引物设计

根据3种根结线虫的测序结果，针对SCAR引物扩增的种类特异区段，采用PrimerExplorerV4 软件，分别设计3种根结线虫的LAMP引物。每种线虫各得到4条LAMP引物,包括2条外引物(F3和B3)和2条内引物(FIP和BIP)。具体见表1。

2.3 3种根结线虫LAMP检测体系建立

采用优化的LAMP扩增体系，分别检测南方、爪哇和花生3种根结线虫。3种根结线虫种群的LAMP扩增产物采用 2种方法均能够成功检测：(1)向LAMP反应产物中加入SYBR GreenⅠ染料，肉眼观察发现，阳性结果呈现绿色，阴性对照则呈现橘红色(图2A、B、C)；(2)LAMP反应产物在 2%琼脂糖凝胶上分离，阳性结果可见LAMP扩增的特异性的梯形条带，阴性结果则无条带(图2D、E、F)。

表1 南方、花生和爪哇根结线虫引物序列Table 1 Primer sequences of M. incognita, M.arenaria and M.javanica

图2 南方、花生和爪哇根结线虫LAMP 体系建立及扩增产物检测Fig.2 Detection results of M. incognita, M. javanica and M. arenaria by LAMPA、B、C依次为南方、花生和爪哇根结线虫的荧光染料检测结果；D、E、F依次为南方、花生和爪哇根结线虫的凝胶电泳检测结果。电泳所用Marker大小为1000 bp。A, B, C: Results of fluorescent dye detection of M. incognita, M. arenaria and M. javanica; D, E, F: Gel electrophoresis results of M. incognita, M. arenaria and M. javanica. The size of Marker used in gel electrophoresis is 1000 bp.

2.4 罹病番茄根组织中3种根结线虫的LAMP直接检测

从分别侵染南方、爪哇和花生3种根结线虫的番茄中随机采10个根结进行LAMP检测，结果发现，南方根结线虫LAMP检测的9个根结为阳性(图3)，花生根结线虫7个根结显示阳性(图4)，爪哇根结线虫5个根结显示阳性，PCR检测结果同步(图5)。由此确定本研究建立的3种 LAMP检测体系能够直接从根结中检测到南方、爪哇、花生根结线虫，具有很高的实际应用价值。

图3 南方根结线虫的LAMP直接检测Fig.3 LAMP direct detection of M. incognita A：电泳检测结果； B：荧光染料检测结果。 A: The results of electrophoresis detection; B: The results of fluorescent dye detection.

图4 花生根结线虫的LAMP直接检测Fig.4 LAMP direct detection of M.arenaria A：电泳检测结果； B：荧光染料检测结果。 A: The results of electrophoresis detection; B: The results of fluorescent dye detection.

图5 爪哇根结线虫的LAMP直接检测Fig.5 LAMP direct detection of M.javanicaA: 电泳检测结果; B: 荧光染料检测结果。 A: The results of electrophoresis detection; B: The results of fluorescent dye detection.

3 讨论与结论

根结线虫的鉴定主要分为形态学鉴定和分子鉴定2种方法，其中形态学鉴定主要是会阴花纹和同工酶电泳方法，而土壤当中大部分是幼虫，限制了2种方法的应用。国内外报道的分子鉴定方法主要是PCR-PFLP分析法(王焱等，2007; Powesetal.,1993),但这种方法需要对PCR产物进行酶切，要耗费较多时间，对操作要求较高，不适合快速鉴定。另外一种分子鉴定方法是RAPD-PCR,Bloketal.(1997)利用此方法鉴定了南方、花生、爪哇3种根结线虫，但RAPD-PCR鉴定过程中对反应条件具有极高的要求(白万明等,1996; Orui,1999)。而本研究建立的直接从植物根结中检测南方、花生、爪哇根结线虫LAMP检测方法，具有快速、便捷、简单、特异性等特点。只需要1 h即可完成反应，与常规PCR相比可以节省大量时间，实验过程中不需要PCR仪、凝胶电泳仪和照胶仪，仅使用水浴锅即可完成检测，操作较为简单，通过加入荧光染料，直接用肉眼观察即可判定结果。但是在反应完成后加入荧光染料的过程中，容易产生气溶胶，造成实验室污染和假阳性，影响LAMP检测结果的准确性，所以应在通风橱中进行实验，并在反应液中加入少量石蜡油密封避免假阳性的出现。该检测方法对3种常见根结线虫的发生分布和监测具有重要的意义，在农业生产中具有很大的应用前景。