血清miRNA-221单独及联合PSA相关指标检测在前列腺癌诊断中的意义

杨晓 张敏 张腊红 潘峰

前列腺癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一，是男性因癌死亡的第3位致死因子[1]。目前，用于辅助诊断前列腺癌的实验室指标主要是前列腺特异性抗原（PSA）相关指标，包括T-PSA、F-PSA、F/T-PSA；在长期临床应用中，PSA相关指标表现出其特异度不足的缺点[2-3]。随着“液体活检”的提出，越来越多的相关实验室指标受到临床上的关注[4]。miRNA是一类长18～25nt的非编码小RNA，与多种疾病的发生、发展密切相关[5]。miRNA-221/222基因定位于X染色体p11.3区域内，成簇分布的miRNA-221/222与肿瘤的发生、发展密切相关。前列腺癌患者的miRNA-221/222表达谱发生了变化，进而导致前列腺癌细胞生长、凋亡、迁移等过程出现紊乱[6-7]。有研究显示，miRNA-221在前列腺癌组织/细胞中的表达水平明显高于正常前列腺组织/细胞[8]。本研究观察并比较了前列腺癌、良性前列腺增生和健康对照者外周血miRNA-221表达差异，并探讨了miRNA-221单独及联合PSA相关指标检测对前列腺癌的诊断效能，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2016年3月至2017年8月收治的43例前列腺癌患者（均经组织病理学确诊）为前列腺癌组，其中杭州师范大学附属医院2例，浙江省肿瘤医院41例；杭州师范大学附属医院同期就诊的37例良性前列腺增生患者为良性增生组；杭州师范大学附属医院同期25例健康体检者为健康对照组。排除心肾功能衰竭、严重肝胆疾病、合并其他恶性肿瘤者。3组对象年龄比较，差异无统计学差异（P＞0.05）。本研究经医院医学伦理委员会审批通过。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 使用促凝真空采血管采集所有对象外周静脉血5ml，待完全凝固后及时分离血清于2个EP管，-80℃保存。

1.2.2 PSA相关指标检测 使用化学发光仪（雅培i4000）检测T-PSA、F-PSA，计算得到F-PSA/T-PSA。

1.2.3 血清miRNA-221检测 （1）血清总RNA提取：①血清中加入1ml Trizol裂解液，漩涡震荡混匀；②加入0.2ml三氯甲烷，剧烈摇动10s，室温放置1min；③4℃，12 000g离心15min；④将上清液转移至另1个新的无RNA酶离心管中，加入等体积的100%乙醇；⑤吸取全部样品，加入带有2ml收集管的离心柱，8 000g室温离心15s，弃流穿液；⑥将剩余样品转移至离心柱，重复第5步；⑦往离心柱中加入700μl清洗缓冲液，轻盖盖子，8 000g室温离心15s，弃流穿液；⑧重复第7步，用500μl清洗缓冲液洗涤离心柱2次；⑨将离心柱转移至1个新的无RNA酶1.5ml离心管中，往硅胶膜中央滴加50μl DEPC水，4℃，10 000g离心3min洗脱RNA。（2）RT-PCR法检测血清miRNA-221含量：使用RTPCR仪（MX3000P，美国安捷伦公司）对上述提取的总RNA进行逆转录反应，总体系20μl，反应条件：42℃30min，85℃10min。以hsa-miR-16为内参，反应体系20μl，反应条件：95℃ 3min 变性，95℃ 12s，62℃ 40s；共40个循环。计算miRNA-221相对表达量。

1.3 统计学处理 应用SPSS 17.0统计软件。计量资料用表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用q检验。单一指标诊断效能的判断采用ROC曲线分析；多个指标联合检测诊断效能的判断先采用logistic回归方程计算预测概率，再进行ROC曲线分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组对象miRNA-221及PSA相关指标检测结果比较 前列腺癌组miRNA-221相对表达量、T-PSA水平、F-PSA水平均明显高于健康对照组、良性增生组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；前列腺癌组、良性增生组F-PSA/T-PSA均明显低于健康对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

表1 3组对象miRNA-221及PSA相关指标检测结果比较

2.2 miRNA-221单独及联合PSA相关指标检测对前列腺癌的诊断效能 与PSA相关指标比较，miRNA-221诊断前列腺癌的AUC、约登指数、灵敏度均较低，特异度较高；miRNA-221联合PSA相关指标未提高对前列腺癌的诊断效能，见表2。

3 讨论

血清PSA相关指标是目前临床应用最广泛的预测前列腺癌的肿瘤标志物，随着其发现与应用，前列腺癌的早期发现与诊断有了明显提高[9-10]。在临床应用中，发现PSA虽然具有组织特异性，但缺乏对前列腺癌诊断的特异度。前列腺炎、良性前列腺增生、前列腺相关检查（直肠指检、经直肠超声检查等）均可引起PSA升高。有研究表明，联合2种及以上指标检测对疾病的诊断效能高于单一指标[11-12]。Dimitry等[12]发现血清中IL-8、TNF-α、sTNFR联合PSA相关指标检测前列腺癌，较单独PSA相关指标的灵敏度和特异度均有不同程度的升高。笔者前期研究发现，联合PLT、纤维蛋白原等检测能提高PSA相关指标对前列腺癌的诊断效能[13]。

表2 miRNA-221单独及联合PSA相关指标检测对前列腺癌的诊断效能

miRNA是一类长18～25nt的非编码小RNA，其表达水平受到染色体重排（缺失、重复、突变等）、启动子甲基化及转录活性等调控机制的影响[5]。近年来研究表明，miRNA能通过调控细胞增殖、凋亡和分化，进而在肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用。随着大量肿瘤特异性miRNA表达谱被发现，miRNA在肿瘤诊断、分级、预后中的作用引起研究者们的关注。当miRNA暴露于较恶劣的条件时，如煮沸、过酸、过碱、反复冻融等，miRNA依然可以保持较高的稳定性。因此，miRNA被认为是理想的无创诊断标志物候选者。研究发现，血清miRNA-210、miRNA-21诊断非小细胞肺癌的AUC为0.845、0.725；两者联合诊断的AUC为0.928，对非小细胞肺癌的诊断具有一定的诊断效能[14]。另一项研究表明，血清miR-767-3p诊断直肠癌的AUC、灵敏度和特异度分别为 0.770、0.800、0.680，而 miR-767-3p 联合血清癌胚抗原诊断直肠癌的AUC、灵敏度和特异度分别为为0.862、0.730、0.840，联合检测有助于直肠癌的诊断[15]。有研究显示，miR-221在胰腺癌、乳腺癌、结直肠癌等肿瘤中表达失调，可以辅助疾病的诊断[16-18]。笔者前期研究发现，miRNA-221在前列腺癌组织/细胞中的表达明显高于正常前列腺组织/细胞。为了探讨miRNA-221在前列腺癌无创诊断中的价值，笔者检测了血清miRNA-221在前列腺癌患者、良性前列腺增生患者及健康对照者中的差异以及联合PSA相关指标检测的效能。结果显示，前列腺癌组miRNA-221相对表达量、T-PSA水平、F-PSA水平均明显高于健康对照组、良性增生组（均P＜0.05）；前列腺癌组、良性增生组F-PSA/T-PSA均明显低于健康对照组（均P＜0.05）。血清miRNA-221单独及联合PSA相关指标对前列腺癌的诊断效能进行比较，结果发现miRNA-221诊断前列腺癌的AUC为0.714，诊断价值中等（AUC 0.5～0.7为诊断价值较低，0.7～0.9为诊断价值中等，＞0.9诊断价值为较高），低于PSA相关指标的诊断效能。当约登指数最大时，miRNA-221具有较高的诊断特异度（0.984），但其灵敏度较低（0.333）。分析灵敏度较低的原因，可能由于血清中miRNA含量与组织细胞miRNA含量的异质性，血清miRNA本身含量较低，或受检测方法灵敏度的局限所致。血清miRNA联合PSA相关指标检测时，对前列腺癌的诊断效能也无明显改善。

综上所述，血清miRNA-221在前列腺癌诊断中具有一定的临床意义，其特异度较高，但灵敏度偏低；联合PSA相关指标检测并未提高对前列腺癌的诊断效能。