绞股蓝总苷颗粒改善高脂血症C57BL/6J小鼠脂代谢的研究

张瑶丹，姜新宇，操兰洁，王 杰，蒋翠花，赵梦鸽，张 健，殷志琦*

(1万邦德制药集团杭州医药技术有限公司，杭州 310000；2湖南华宝通制药有限公司，长沙 410331；3中国药科大学中药学院中药制剂系&天然药物活性组分与药效国家重点实验室，南京 210009；4江苏省中医药研究院转化医学实验室，南京 210028)

高脂血症极易诱发动脉粥样硬化、冠心病等其他心脑血管疾病，严重威胁患者健康，据统计，预计到2020年，心脑血管疾病的病死率会达到37%[1]。目前临床一线用药为他汀类，主要通过竞争性抑制内源性胆固醇合成限速酶即HMG-CoA还原酶，阻断细胞内羟甲戊酸代谢途径，使细胞内胆固醇合成减少[2]。但许多患者接受他汀类药物治疗后达不到美国国家卫生研究院提出的降脂目标，且部分患者会产生耐药性，多项临床研究报道他汀类药物在降脂的同时可能会引起体内转氨酶升高，从而影响肝功能[3-4]。天然药物具有多靶点、多机制和整体协同的作用特点，对于高脂血症等长期慢性疾病的治疗具有可长期服用，不良反应小等优势，因此成为降脂药物开发应用的关注焦点。将天然药物与化学药联合用药，具有减毒增效的潜力，是临床降脂用药趋势和今后研究的重点[5-6]。

绞股蓝[GynostemmaPentaphyllum(Thunb.) Makino]是葫芦科绞股蓝属植物，民间称其为“不老药草”，又名“南方人参”，主要含有人参皂苷Rb1等多种皂苷类成分[7]。1986年国家科委在“星火计划”中，把绞股蓝列为待开发的“名贵中药材”之首。目前药理研究发现绞股蓝皂苷具有降血脂、保肝、抗炎、抗氧化、调节免疫、抗肿瘤及保护心脑血管等多种药理活性[8-9]。

本实验以绞股蓝总苷颗粒为评估对象，采用高脂饲料诱导高脂血症C57BL/6J小鼠模型，评估其对高脂血症C57BL/6J小鼠的降脂作用以及对血清转氨酶的影响，尤其考察该产品与阿托伐他汀联合用药的降脂药效和安全性，并初步探索其调节脂质代谢相关机制。

1 材 料

1.1 药品与试剂

总胆固醇测定试剂盒(批号20160729)、甘油三酯测定试剂盒(批号20160729)、高密度脂蛋白试剂盒(批号20160729)、低密度脂蛋白试剂盒(批号20160729)、谷氨酸转氨酶测试盒(批号20160729)、天冬氨酸转氨酶测试盒(批号20160729)、鼠源载脂蛋白B ELISA试剂盒(批号20160729)，以上均为南京建成生物工程研究所产品。阿托伐他汀片为辉瑞制药有限公司产品(批号20151126)。

绞股蓝总苷颗粒[湖南华宝通制药有限公司；批号：20160302；规格：每袋装3 g(含绞股蓝皂苷45 mg)]；临床用药剂量：一次1袋，一日3次；本研究试验动物使用剂量为文献报道常规试验剂量[10]。药物以0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液稀释，4 ℃保存。

1.2 动物及饲料

SPF级C57BL/6J小鼠，体重16～18 g，雄性，购自南通大学动物中心(许可证号：SCXK(苏)2014-0001)，所有动物实验均符合动物伦理委员会标准。高脂饲料(编号：TP24200，3.4 kCal/g，其中，蛋白质热量22%，脂肪13%，碳水化合物65%)由南通特洛菲饲料科技有限公司生产。

1.3 仪 器

Synergy H1酶联免疫检测仪(美国伯腾仪器有限公司)；Allegra 64R超速控温离心机(美国贝克曼库尔特有限公司)；Axio Observer A1荧光倒置显微镜(德国卡尔·蔡司股份公司)。

2 方 法

2.1 小鼠模型制备及分组

C57BL/6J小鼠适应性喂养1周后，按体重随机分组。正常对照组小鼠(15只)给予基础饲料喂养，高脂血症组小鼠(105只)给予高脂饲料喂养造模。造模4周后检测血脂指标，判断模型是否成功。将高脂造模小鼠(105只)按血脂水平随机分为7组，每组15只，各组饲养条件不变。空白组、模型组，灌胃等体积0.05%CMC-Na溶液；阳性药组(Lip)，给予阿托伐他汀溶液10 mg/kg；绞股蓝总苷颗粒低、中、高剂量组(L,M,H)，分别给予绞股蓝总苷颗粒90、120、180 mg/kg(以绞股蓝皂苷计)；联合组(Lip+H)给予绞股蓝总苷颗粒180 mg/kg+阿托伐他汀10 mg/kg，持续给药4周，实验期间所有动物自由饮水及饮食。

2.2 生理状况、摄食量、体重变化

每日监测小鼠健康情况，包括精神状况、日常活动、进水情况及毛发颜色等。每天定量给予饲料，并记录剩余饲料，每周称量小鼠体重。平均摄食量=(给予饲料-剩余饲料)/小鼠只数,平均体重=各组小鼠体重之和/小鼠只数。

2.3 样本采集与保存

2.3.1 血清样本 给药4周后，小鼠禁食12 h，眼眶取血0.2～0.3 mL，3 000 r/min 离心10 min分离血清样本，-80 ℃保存。

2.3.2 组织样本 给药4周后，小鼠禁食12 h，处死后立即取出肝及腹部、附睾、肾周脂肪组织，生理盐水冲洗，纱布吸干后称重，-80 ℃保存。

2.4 血清生化指标的测定

给药4周后，检测血清TC、TG、HDL-C、LDL-C，ApoB含量；肝功能指标ALT、AST含量。

2.5 小鼠胰腺组织苏木精-伊红(HE)染色法

小鼠处理后，将福尔马林固定好的胰腺组织经石蜡切片后，HE染色，然后置于显微镜镜下，观察胰腺组织变化。

2.6 肝脏TC代谢相关基因表达水平检测

取各组肝组织100 mg，液氮中磨碎，加入缓冲液裂解，提取总RNA。用RT-PCR法测定相关基因表达量(表1)。

Table 1 Quantitative real-time PCR primers

GeneForward primerReverse primerLXRα5′-TGGAGACATCTCGGAGGTAC-3′5′-AGCAATGAGCAAGGCAAACT-3′ABCA15′-AAGAACCAGCTGGGAACAGG-3′5′-CAGCGTGTCACTCTCATGGT-3′CYP7A15′-GACATCATAGCTCTTTACCCACA-3′5′-GGTAGTCTTTGTCTTCCCGTTTT-3′LDLR5′-TCAGGCTAAAGGTCAGCTCC-3′5′-TCTCATTTCCTCTGCCAGCA-3′ABCG55′-AGCAAGGAACGGGAAATAGA-3′5′-CAGGAGAACACCCAGTTTAGAG-3′ABCG85′-GATACAGCCGCCCTCTTGTT-3′5′-GCCCGTCTTCCAGTTCATAG-3′SR-BI5′-CTCCCATCCTCACTTCCTCAA-3′5′-AATGCCTGCGACAGATTTCA-3′SREBP-25′-GTCCTGAGCGTCTTTGTGA-3′5′-CCAGGCAGGTTTGTAGGTT-3′

2.7 肝脏TC代谢相关蛋白表达水平检测

取各组肝组织100 mg，用组织裂解液裂解并匀浆，然后在4 ℃以15 000 r/min离心30 min，取上清液作样本，用Western blot检测LXRα和ABCA1 蛋白表达水平。

2.8 统计学处理

3 结 果

3.1 绞股蓝总苷颗粒对小鼠体重、摄食量及相对脏器质量的影响

结合摄食量和体重变化观察(表2、表3)，高脂饲料喂养4周后，模型组小鼠较空白组摄食量差异不大，但小鼠体重明显上升，第5周后模型组小鼠体重较空白组具有显著性差异(P<0.05)。给药后，绞股蓝总苷颗粒低、中、高剂量组小鼠较模型组小鼠体重均有下降趋势，在第7、第8周时各组小鼠体重较模型组均显著性降低(P<0.05)。如表4所示，小鼠经高脂饲料喂养后，模型组小鼠的肝、肾周脂肪、附睾脂肪、腹部脂肪较空白组重量显著增加(P<0.05)。给药干预后，联合组小鼠的腹部脂肪和附睾脂肪重量以及绞股蓝总苷颗粒低剂量组和高剂量组小鼠的腹部脂肪重量较模型组明显降低(P<0.05)。以上结果提示绞股蓝总苷颗粒可以改善高脂饮食导致的小鼠内脏脂肪沉积。

Table 2 Weekly average food intake of C57BL/6J mice (n=8- 12)

GroupFood intake/g12345678 weekBlank13.114.316.817.312.614.513.59.7Model11.514.116.518.217.213.713.112.1Lip10.013.917.817.915.312.810.912.9L10.715.217.318.916.310.511.511.8M11.111.518.017.118.413.511.38.8H13.313.119.018.615.68.911.510.9Lip+H11.813.315.118.015.59.911.910.0

Lip:10 mg/(kg·d) of Lipitor;L:90 mg/(kg·d) of gypenosides granules;M:120 mg/(kg·d) of gypenosides granules;H:180 mg/(kg·d) of gypenosides granules;Lip+H:180 mg/(kg·d) of gypenosides granules and 10 mg/(kg·d) of lipitor

GroupBody weight/g12345678 weekBlank22.73±1.3523.26±1.5524.18±1.6524.84±1.8024.89±2.0424.76±1.4425.55±1.2525.55±1.36Model23.97±1.2324.54±1.9325.81±1.7626.6±1.3326.33±1.74#26.9±1.69#28.4±1.76#28.4±1.31##Lip22.95±1.5523.22±1.8025.22±1.5326.61±1.3926.18±1.2326.17±2.0027.58±2.1627.58±2.37L23.28±1.124.09±2.0724.98±1.5625.78±2.2725.39±2.5924.83±2.86∗24.03±2.01∗24.03±2.37∗M23.6±1.7123.38±1.3925.02±1.5426.1±1.6326.23±1.8326.23±2.2626.44±2.89∗26.44±2.76∗H24.1±0.8823.87±1.3824.99±1.7026.97±1.5726.33±1.2626.2±1.6127.71±0.83∗27.71±0.85∗Lip+H23.95±1.2924.71±1.2225.02±1.8526.37±1.9326.44±1.426.42±3.5324.8±3.9424.8±3.78

#P<0.05,##P<0.01vsblank group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

GroupLiver/gBelly fat/gPerirenal fat/gEpididymis fat/gBlank0.91±0.160.09±0.020.05±0.000.47±0.12Model1.14±0.19#0.20±0.09#0.06±0.02#0.76±0.25#Lip1.13±0.210.16±0.090.08±0.030.86±0.33L1.02±0.090.11±0.05∗0.06±0.020.67±0.22M1.08±0.180.17±0.140.06±0.020.67±0.19H1.12±0.230.12±0.04∗0.08±0.030.68±0.07Lip+H1.11±0.230.12±0.08∗0.07±0.030.53±0.28∗

#P<0.05,##P<0.01vsblank group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

3.2 绞股蓝总苷颗粒对小鼠血清生化指标的影响

本研究采用高脂饮食诱导C57BL/6J小鼠产生高脂血症，药物干预四周后，检测C57BL/6J小鼠血清生化指标，结果如表5所示。与模型组比较，药物干预后均能明显降低小鼠血清TC含量(P<0.05)，其中联合组的药效优于绞股蓝总苷颗粒高剂量组及阳性药组。绞股蓝总苷颗粒低、中、高剂量组及联合组均有升高HDL-C、降低LDL-C水平的作用趋势，阳性药组较模型组能明显升高小鼠血清HDL-C含量(P<0.05)。

肝功能相关指标检测结果显示，持续喂养高脂饲料导致模型组小鼠血清ALT、AST水平显著升高，诱发肝损伤。给予绞股蓝总苷颗粒干预后，与模型组相比，绞股蓝总苷颗粒低、中、高剂量组均能明显降低血清AST水平(P<0.05)。根据检测结果发现，绞股蓝总苷颗粒低剂量组及联合组较模型组ApoB含量有所降低，但无显著性差异；而阳性药组较模型组能明显减少小鼠ApoB的分泌(P<0.05)。以上结果提示绞股蓝总苷颗粒能够改善高脂血症小鼠血清TC指标，降低血清转氨酶含量，有效缓解肝损伤。

GroupTC/(mmol/L)TG/(mmol/L)HDL-L/(mmol/L)LDL-L/(mmol/L)AST/(U/L)ALT/(U/L)APOB/(mmol/L)Blank4.02±0.571.50±0.345.60±0.680.38±0.3243.68±9.0715.27±4.13161.21±24.35Model6.91±1.09∗∗1.45±0.364.62±0.87∗1.33±0.78∗∗78.17±18.08∗∗23.78±6.07∗243.46±23.48∗∗Lip5.20±0.95##1.51±0.416.65±0.99##1.30±0.1955.53±14.69#23.66±5.77109.00±25.80##L4.86±0.44##1.47±0.275.20±0.481.39±0.2149.82±14.73##28.00±3.75228.39±16.33M5.20±0.60##1.53±0.545.20±0.701.37±0.2240.79±8.16##25.58±6.84279.21±25.50H5.88±1.701.54±0.245.31±0.531.32±0.2242.29±10.84##23.97±5.71306.43±20.79Lip+H4.68±0.56##1.14±0.12∗5.53±0.971.16±0.1958.76±8.9922.81±3.50229.91±26.91

#P<0.05,##P<0.01vsblank group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

3.3 肝脏HE染色

各组小鼠肝脏HE染色结果如图1所示。空白组小鼠肝脏小叶结构清晰，肝细胞排列有序。高脂饮食诱导后，模型组小鼠肝细胞排列紊乱，出现空泡，并伴有脂滴蓄积，肝索结构不清晰。给予药物干预后，绞股蓝总苷颗粒低、中、高剂量组较模型组脂滴明显减少，空泡消失；联合组脂滴减少，肝细胞排列较整齐，肝索结构清晰，肝细胞状态趋于正常肝细胞；阳性药组表现出与联合组类似的药效。以上结果说明绞股蓝总苷颗粒对受损小鼠肝细胞有保护和促进修复作用。

Figure 1 Effect of gypenosides granules on liver in C57BL/6J mice by HE staining (×200)

3.4 绞股蓝总苷颗粒对小鼠肝脏胆固醇代谢相关蛋白与基因表达的影响

为探究绞股蓝总苷颗粒降脂的作用机制，考察小鼠肝脏胆固醇代谢关键因子蛋白、基因表达水平。如图2所示，经高脂饮食诱导后，模型组较空白组LXRα蛋白量明显上升(P<0.05)、ABCA1的蛋白表达量则恰恰相反(P<0.05)。给药干预后，绞股蓝总苷颗粒低剂量组LXRα蛋白表达量较模型组呈下降趋势，但无显著性差异；ABCA1的蛋白表达却显著上调(P<0.05)。

肝脏TC代谢相关基因表达如图3所示。相比空白组，模型组LXRα基因表达量明显上升，ABCA1、CYP7A1、SR-BΙ、LDLR及SREBP-2的基因表达量明显下降(P<0.05)。给药干预后，LXRα基因表达量具有一定下降趋势；绞股蓝总苷颗粒低剂量组ABCA1、CYP7A1、SR-BΙ的基因表达量显著上调(P<0.05)，LDLR及SREBP-2基因表达量呈增长趋势，但与模型组相比无显著性差异。

4 讨 论

本实验采用高脂饮食成功诱导小鼠高脂血症模型，模型小鼠血清胆固醇含量显著升高，同时出现肝脏损伤症状。本研究发现绞股蓝总苷颗粒低、中剂量组均可以显著改善机体胆固醇水平，联合组较阳性药组以及绞股蓝总苷颗粒高剂量组降脂效果更显著，并且有效缓解肝脏损伤，降低血清转氨酶含量。

脂质异位是指脂质在肝脏、肌肉、β细胞、心以及内皮细胞等非脂肪细胞的沉积。腹内脂肪与HDL-C呈负相关，与LDL-C呈正相关，过度积累的内脏脂肪组织可释放大量游离脂肪酸(FFA)进入血液循环，促使胰腺、肝脏及骨骼肌等组织吸收过多的FFA，损害胰岛素依赖的代谢过程，内脏脂肪还可分泌炎症因子，影响体内其他代谢过程，引发糖尿病等其他并发症[11]。他汀类在高剂量使用时，也可能会增加病人患糖尿病的风险[12]。已经有研究表明绞股蓝可以降低超重和胰岛素抵抗风险，具有潜在的降糖效果[13-14]。本研究显示绞股蓝总苷颗粒可减少小鼠腹部脂肪蓄积量，与他汀联用后可防止体重增加以及相关并发症的产生。

#P<0.05vsblank group;*P<0.05vsmodel group

#P<0.05vsblank group;*P<0.05vsmodel group

有学者发现绞股蓝皂苷干预后对天冬氨酸AST转氨酶有特定的效果，优于阳性药罗格列酮、辛伐他汀和非诺贝特，并对胆汁酸通路产生影响，推断绞股蓝皂苷可能是通过促进肝脏胆汁酸的合成起到防治肝损伤的作用[15]。本研究结果显示，绞股蓝总苷颗粒还可减少血清中AST含量，修复小鼠受损的肝细胞，提示绞股蓝总苷颗粒可以减轻高脂诱导的肝脏损伤，具有潜在的护肝作用。因此推测绞股蓝总苷颗粒与他汀联用后，可显著逆转他汀导致的转氨酶升高，减少其不良反应发生率。

在胆固醇逆转运过程中，TC经肝外组织和巨噬细胞流出胞外，经HDL摄取后，与细胞表面的ABCA1相结合，再在LCAT的作用下，HDL游离胆固醇酯化后形成胆固醇酯，然后SR-BΙ将胆固醇酯重新转运至肝脏代谢为胆汁酸，排出体外[16-17]。激活CYP7A1能够调节胆汁酸的代谢与合成，减少TC在肝脏的堆积[18]。由此可见，ABCA1、CYP7A1和SR-BΙ对调节TC代谢具有重要影响。本研究发现绞股蓝总苷颗粒不仅能够促进ABCA1的蛋白表达，还能上调ABCA1、CYP7A1和SR-BΙ的基因表达，因此，推测绞股蓝总苷颗粒能通过影响ABCA1、CYP7A1和SR-BΙ的活性参与肝脏TC代谢，从而降低机体的TC含量。此外，文献研究证实LXRα可通过调节ABCA1、ABCG5/G8及CYP7A1的活性来影响胆固醇逆转运[19]研究发现经绞股蓝总苷颗粒干预后，LXRα呈下降趋势，ABCA1和CYP7A1表达量明显上调，绞股蓝总苷颗粒降TC的机制可能是独立调节LXRα及ABCA1等靶点。现有诸多报道如法尼酯受体(FXR)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)等其他受体也能通过作用于ABCA1、CYP7A1或其他相关蛋白从而调节胆固醇逆向转运[20-21]。因此，绞股蓝总苷颗粒是如何调节ABCA1、CYP7A1等肝脏TC代谢相关蛋白的活性来维持体内TC的稳态还需进一步研究。本研究发现阳性药阿托伐他汀对ABCA1、ABCG5/G8及CYP7A1的影响趋势与绞股蓝总苷颗粒低剂量组类似，据报道阿托伐他汀通过抑制小鼠肝脏和肠道的FXR信号通路，诱导胆汁酸合成酶CYP7A1[22]，与绞股蓝总苷颗粒联用后可协同发挥降脂效果。

本研究证实绞股蓝总苷颗粒对高脂饮食诱导的高脂血症小鼠有一定的治疗作用，与他汀联用后效果更佳，并可改善他汀升高转氨酶的副作用，改善肝功能。后续将继续深入探索绞股蓝总苷颗粒与他汀联用的机制，明确最佳联用剂量，为绞股蓝总苷颗粒在临床上的应用提供理论依据。