D-半乳糖诱导的小鼠耳蜗带状突触损伤

杜政德 宋青玲 韩曙光 柳柯 龚树生*

1首都医科大学附属北京友谊医院耳鼻咽喉科（北京100050）

2中国航天科工集团731医院耳鼻咽喉科（北京100074）

老年性聋又称为年龄相关性听力损失，是老化在听觉系统的表现[1]。衰老是一个长期缓慢的过程，由于无法从人类活体取得听觉组织标本以及个体基因和环境等因素的影响，使得老化机制和抗老化的研究受到很大的限制。因此，研究者建立了许多快速衰老的动物模型，用于研究老化机制及干预策略。D-半乳糖诱导的衰老动物表现为学习记忆能力的快速减退，线粒体功能紊乱，凋亡发生增加，这些表现和自然老化现象高度一致，成为一种常用的衰老动物模型，被广泛用于听觉及其他系统老化机制及干预的研究[2-5]。

在先前的研究中，研究者发现D-半乳糖诱导的衰老动物表现为耳蜗氧化应激增加和线粒体DNA损伤加重，伴随少量血管纹边缘细胞凋亡，而无毛细胞和螺旋神经节细胞的明显丢失，也不会引起明显的听性脑干反应（auditory brain response，ABR）阈移，但对耳毒性药物、高脂饮食以及噪声等危险因素敏感性明显增加[6,7]。近年来，国外文献报道耳蜗内毛细胞和螺旋神经节细胞之间的带状突触是小鼠耳蜗老化过程中最先出现的损伤部位，早期耳蜗带状突触数量的减少并不能引起ABR阈值增加，仅表现为ABR I波幅值的降低[8]。虽然，D-半乳糖诱导的衰老动物听功能损伤和动物自然衰老早期存在相似性，但尚无文献报道D-半乳糖诱导的衰老动物耳蜗带状突触变化的情况。

在本研究中，我们利用D-半乳糖诱导的衰老小鼠模型，采用免疫组织化学激光共聚焦显微镜成像技术，观察耳蜗带状突触的数量变化，探讨衰老过程中导致耳蜗带状突触损伤的可能机制。

1 材料和方法

1.1 D-半乳糖诱导的衰老小鼠模型的构建

24只5周龄雄性C57BL/6J小鼠购自首都医科大学实验动物中心，适应性饲养1周后随机分为两组：①对照组：小鼠颈背部皮下注射同体积的生理盐水，每日1次，连续6周；②D-半乳糖组：小鼠颈背部皮下注射1000mg/kg D-半乳糖（sigma，美国），每日1次，连续6周。所有动物均饲养在室温约20-22°C左右，12小时昼夜交替的环境中，自由进食饮水。两组动物均无噪声暴露史，无其它药物使用史。所有实验动物的饲养和研究严格遵守首都医科大学实验动物管理规定。

1.2 听功能检测

小鼠听功能由ABR检测。对照组和D-半乳糖组小鼠（每组6只）腹腔内注射氯胺酮（100 mg/kg）和盐酸赛拉嗪（10 mg/kg）麻醉。待充分麻醉后，将其移入隔声屏蔽室内，连接电极，测试参考电极，记录电极插入颅顶正中骨质内。测试电阻小于3kΩ。调整给声喇叭使之贴近外耳道但不接触耳廓，以减少误差。以短纯音（Tone burst）作为刺激声，测试实验动物在8k、16k、32kHz各个频率ABR阈值和90dB SPL声强刺激下I波幅值。以能分辨出可重复的ABR波Ⅲ的最低刺激强度判断阈值。

1.3 耳蜗带状突触计数

免疫组织化学染色标记耳蜗内毛细胞带状突触突触前蛋白CtBP2，CtBP2的数量用于耳蜗带状突触计数。颈椎脱臼法处死对照组和D-半乳糖组小鼠（每组4只），快速取出耳蜗，放入4%多聚甲醛溶液。在解剖显微镜下，用细针在蜗顶钻孔，并开放圆窗和卵圆窗。用4%多聚甲醛溶液自蜗顶进行灌流，冲出淋巴液，4℃冰箱固定过夜。第二天，将标本置于10%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液中脱钙2h后，在解剖显微镜下，用显微镊去除已脱钙的耳蜗蜗壳、外侧壁、前庭膜及盖膜，分离出基底膜。将基底膜置于0.3%Triton X-100+2%BSA（bovine serum albumin，牛血清白蛋白）中破膜和封闭30min，加入小鼠来源的CtBP2（1：500稀释，BD Biosciences，美国）和标记内毛细胞的Myosin VIIa（1:500稀释，Abcam，美国）一抗4℃过夜，PBS冲洗3次；加入合适的二抗，37℃避光染色1h，PBS冲洗3次，含DAPI（标记细胞核）的封片剂封片激光共聚焦显微镜扫描和计数。激光共聚焦显微镜设定的扫描层距为0.35μm。

1.4 耳蜗带状突触突触前CtBP2蛋白的检测

对照组和D-半乳糖组小鼠（每组4只）颈椎脱臼处死后，快速取出双侧耳蜗，放入装有RIPA裂解液（碧云天，中国）中，提取总蛋白，并用BCA法进行蛋白定量。将蛋白样品上样于SDS-PAGE凝胶不同泳道的电泳孔中，用电压80V跑过浓缩胶后转换电压至120V，待溴酚蓝位于凝胶底边，改用恒流200mA将目的蛋白转于PVDF膜上，然后用含5%脱脂牛奶的TBST缓冲液室温下封闭2小时，再加入一抗anti-CtBP2（1:1000稀释,BD Biosciences，美国）、anti-GAPDH（1:1000,CST,美国），4℃过夜。第二天，用TBST缓冲液洗膜3次，每次5min，加入HRP标记的二抗（1:5000,中杉金桥，中国），室温下孵育1小时，再次用TBST缓冲液洗膜3次，每次5min。在暗室内使用ECL发光液A,B（碧云天，中国）按1:1比例混合，加至PVDF膜上，放入暗盒内，压片曝光。对曝光好的胶片进行固定、扫描和保存，用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件（Media Cybernetics,Inc.,美国）进行半定量分析。

1.5 耳蜗内毛细胞线粒体DNA氧化损伤产物8-羟基-2-脱氧鸟苷（8-hydroxy-2-deoxyguanosine,8-OHdG）的检测

颈椎脱臼法处死对照组和D-半乳糖组小鼠（每组4只），快速取出耳蜗，放入4%多聚甲醛溶液，4℃冰箱固定过夜。第二天，将标本置于10%EDTA溶液，4℃冰箱脱钙3天。经30%蔗糖脱水后用OCT包埋，使用冰冻切片机（Leica，美国）行耳蜗中轴位切片。耳蜗切片置于PBS浸泡10min，去除OCT，用免疫组化笔围绕组织画圈，滴加0.3%Triton X-100+2%BSA破膜和封闭30min，加入anti-8-OHdG（1：300稀释，Abcam，美国）和anti-Myosin VIIa（1:300稀释，Abcam，美国）一抗4℃过夜，PBS冲洗3次；加入合适的二抗，37℃避光染色1h，PBS冲洗3次，含DAPI的封片剂封片激光共聚焦显微镜扫描，用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件进行半定量分析。

1.6 统计学方法

所有实验数据采用SPSS 13.0（SPSS Inc.,美国）统计软件行两个独立样本的t检验，所有实验数据用平均值±标准差表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 D-半乳糖诱导的衰老小鼠ABR I波幅值降低

在8 kHz、16 kHz和32 kHz频率，对照组小鼠ABR阈值分别为24.29±1.27 dB SPL、27.50±1.14 dB SPL和60.36±3.03 dB SPL，D-半乳糖诱导的衰老小鼠ABR阈值分别为26.07±2.52 dB SPL、32.50±2.91 dB SPL和62.86±5.07 dB SPL（图1A），两组小鼠ABR阈值相比较无统计学差异（t=-0.632,P＞0.05;t=-1.601,P＞0.05;t=-0.423,P＞0.05）；在90dB SPL声强刺激下，对照组小鼠ABR I波幅值分别为1.21±0.08 μv、0.92±0.07μv 和0.43±0.04 μv，D-半乳糖诱导的衰老小鼠ABR I波幅值分别为0.83±0.09 μv、0.66±0.05μv 和0.24±0.05 μv（图1B），两组小鼠ABR I波幅值相比较有统计学差异（t=3.216,P＜0.01;t=2.925,P＜0.01;t=3.116,P＜0.01），D-半乳糖诱导的衰老小鼠ABR I波幅值比对照组小鼠明显降低。

图1 对照组和D-半乳糖诱导的衰老小鼠听功能（A）对照组和D-半乳糖诱导的衰老小鼠ABR阈值；（B）对照组和D-半乳糖诱导的衰老小鼠ABR I波幅值。**P＜0.01。Fig.1 The auditory function in the Control mice and D-galactose-induced aging mice.(A)The threshold of ABR in the Control mice and D-galactose-induced aging mice.(B)The amplitude of ABR I wave in the Control mice and D-galactose-induced aging mice.**P＜0.01.

2.2 D-半乳糖诱导的衰老小鼠耳蜗带状突触数量下降

对照组和D-半乳糖诱导的衰老小鼠耳蜗基底膜铺片显示耳蜗内毛细胞（Inner hair cells,IHCs）和外毛细胞（Outer hair cells,OHCs）无丢失（图2A），用特异性标记耳蜗内毛细胞带状突触突出前的抗体CtBP2检测（图2A）发现：对照组小鼠耳蜗平均每个内毛细胞带状突触数量为13.63±0.85，D-半乳糖诱导的衰老小鼠耳蜗平均每个内毛细胞带状突触数量为8.75±1.32（图2B），D-半乳糖诱导的衰老小鼠耳蜗带状突触数量比对照组显著减少（t=6.192,P＜0.01）。

图2 耳蜗基底膜铺片计数耳蜗带状突触数量（A）耳蜗基底膜铺片CtBP2（红色）标记耳蜗带状突触突触前，Myosin VIIa（绿色）标记内毛细胞（IHCs）和外毛细胞（OHCs）细胞浆，DAPI（蓝色）标记IHCs和OHCs细胞核；（B）定量分析平均每个内毛细胞带状突触数量。**P＜0.01。Fig.2 The number of ribbon synapses counted by cochlear flat-surface preparation in the Control group and D-galactose group.(A)Representative images of IHC ribbon synapses.IHCs stained by myosin VIIa(green),ribbon synapses stained by CtBP2(red),the nuclei stained by DAPI(blue).(B)The number of CtBP2 per IHC in the Control group and D-galactose group.**P＜0.01.

2.3 D-半乳糖诱导的衰老小鼠耳蜗带状突触突触前CtBP2蛋白水平表达明显下降

为进一步定量分析D-半乳糖诱导的衰老小鼠耳蜗带状突触数量的变化，我们利用western blot技术检测了两组小鼠耳蜗带状突触突触前蛋白Ct-BP2的表达（图3A）。D-半乳糖诱导的衰老小鼠耳蜗CtBP2蛋白水平是对照组的0.61±0.04倍（图3B），D-半乳糖诱导的衰老小鼠耳蜗CtBP2蛋白水平比对照组显著降低（t=3.711,P＜0.01）。

图3 耳蜗带状突触突触前蛋白CtBP2的表达（A）western blot检测对照组和D-半乳糖组小鼠耳蜗CtBP2蛋白的表达；（B）定量分析CtBP2蛋白水平的表达。**P＜0.01。Fig.3 The CtBP2 protein expression in the Control group and D-galactose group.(A)Representative images of CtBP2 protein expression tested by western blot.(B)Quantitative analysis of CtBP2 protein in the Control group and D-galactose group.**P＜0.01.

2.4 D-半乳糖诱导的衰老小鼠耳蜗内毛细胞线粒体DNA氧化损伤产物8-OHdG表达明显升高

免疫组织化学激光共聚焦显微镜成像显示DNA氧化损伤产物8-OHdG[9,10]主要位于D-半乳糖诱导的衰老小鼠耳蜗内毛细胞的细胞浆（图4A），由于细胞浆中仅存在线粒体DNA，说明D-半乳糖主要导致了线粒体DNA的氧化损伤；定量分析8-OHdG在D-半乳糖诱导的衰老小鼠耳蜗内毛细胞的表达水平比对照组增加6.80±0.59倍（图4B）（t=-9.816,P＜0.01）。

图4 DNA氧化损伤产物8-OHdG在耳蜗的表达（A）8-OHdG（红色）标记DNA氧化损伤产物，Myosin VIIa（绿色）标记内毛细胞（IHC）和外毛细胞（OHCs）细胞浆，DAPI标记细胞核；（B）定量分析8-OHdG的相对表达。**P＜0.01。标尺=20 μm。Fig.4 The expression of 8-OHdG,a marker of DNA oxidative damage,in the cochlea of Control group and D-galactose group.(A)Representative images of 8-OHdG expression in the cochlea tested by immunohistochemical staining.(B)The relative expression of 8-OHdG in the cochlea of Control group and D-galactose group.**P＜0.01.

3 讨论

根据以上实验结果，我们首次证实耳蜗带状突触数量减少是D-半乳糖诱导的衰老小鼠耳蜗早期的病理改变，反映耳蜗带状突触功能的ABR I波幅值也相应降低，这一变化和小鼠的自然老化过程类似[8]。利用这一模型，研究者可以在较短的时间内（D-半乳糖注射6周）观察到耳蜗带状突触数量的减少和功能的降低，而自然老化小鼠需要大约16周才能观察到耳蜗带状突触数量减少[11]。因此，D-半乳糖诱导的衰老小鼠可用于老化过程中突触损伤发生机制及干预的研究。

带状突触仅存在于耳蜗和视网膜，听觉的形成依赖于耳蜗带状突触的正常功能，耳蜗带状突触突触前膜囊泡的转运、聚集和量子式释放是维持正常突触功能的关键[12]。在突触前膜囊泡转运的过程，需要消耗大量内毛细胞线粒体产生的ATP。因此，线粒体在维持突触功能方面起着至关重要的作用[13-15]。线粒体在能量代谢的过程中，不仅可以提供维持细胞正常生理功能的ATP，同时也会产生活性氧。根据线粒体老化理论，在老化过程中，随着机体氧化/抗氧化的失衡，导致活性氧产生增加，加重线粒体的氧化损伤，损伤的线粒体又产生更多的活性氧，形成恶性循环[16]。在本研究中，我们发现D-半乳糖诱导的衰老小鼠耳蜗内毛细胞线粒体DNA氧化损伤明显增加，可能导致线粒体功能下降，ATP产生减少，最终不能给耳蜗带状突触突触前膜囊泡转运提供足够的能量，导致耳蜗带状突触数量减少和功能降低。

综上所述，给小鼠皮下注射D-半乳糖可损伤耳蜗带状突触，导致耳蜗带状突触数量减少和功能降低，耳蜗内毛细胞线粒体氧化损伤可能是耳蜗带状突触损伤的重要原因，D-半乳糖诱导的衰老小鼠是研究老化过程中耳蜗带状突触损伤机制及干预较为理想的动物模型。