猕猴桃根石油醚提取物α-葡萄糖苷酶抑制活性及GC-MS成分分析

聂昌平，吴丹，杨俊，万路平，梁光平，*

（1.遵义医药高等专科学校，贵州遵义563006；2.遵义市第五人民医院，贵州遵义563000）

猕猴桃根来源于猕猴桃科植物猕猴桃（Actinidia chinensisPlanch.）的根或根皮，主要分布于我国陕西、江西、湖南、湖北、福建、浙江、河南、安徽等省，具有活血消肿、祛风利湿、清热利尿、散热止血的功效[1]。猕猴桃根成分类型主要有三萜、黄酮、甾体、蒽醌、酚酸、木质素、挥发油、糖类、鞣质、香豆素、生物碱、脂肪等[2]。现代药理学研究表明，猕猴桃根具有抗肿瘤[3-5]、抗氧化[6]、抗血栓[7]、增强免疫力[8-9]以及抗病毒[10-11]作用。前期研究还发现[12]，猕猴桃根乙醇提取物的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部位对α-葡萄糖苷酶具有抑制作用。而α-葡萄糖苷酶在人类的糖原降解和动物、植物、微生物的糖类代谢方面具有重要的生理功能[13]。同时，α-葡萄糖苷酶抑制剂也是作为治疗糖尿病的首选药物，被视为最具临床治疗应用价值的降血糖药物[14]。为进一步挖掘猕猴桃根在防治糖尿病方面的价值，本研究对猕猴桃根石油醚提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性进行研究，采用气相色谱-质谱联用技术（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析检测猕猴桃根石油醚提取物的组成成分，为猕猴桃根的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猕猴桃根：贵州省遵义市新蒲新区虾子镇，经遵义医药高等专科学校张学愈副教授鉴定为猕猴桃科植物中华猕猴桃（Actinidia chinensisPlanch.）的根或根皮，样本存放于遵义医药高等专科学校药学系。

α-葡萄糖苷酶（500 000 U/g）：日本OSAKA BIO 公司；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）：Sigma 公 司 ； 阿 卡 波 糖（acarbose）：德国拜耳公司；石油醚（60 ℃～90 ℃）、三氟化硼、氢氧化钠、甲醇、正庚烷、二氯甲烷、二甲基亚砜、磷酸钾、碳酸钠、氯化钠：阿拉丁试剂公司；以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HP6890/5975C 型气相色谱-质谱联用仪：美国安捷伦公司；Max-190 型酶标仪：美国Molecular Devices公司；N-1100V-W/WD 型旋转蒸发仪：东京理化器械株式会社；96 孔细胞培养板：美国Cambridge MA 公司；DZF-1 型真空干燥箱：北京市永光明医疗仪器有限公司；D7031EASYpure II 超纯水机：巴恩斯特德国际有限公司；SPX-150B-Z 型生化培养箱：浙江力辰仪器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品的提取

取猕猴桃根粗粉150 g 于圆底烧瓶，加入300 mL石油醚（60 ℃～90 ℃），加热回流提取3.0 h，静置冷却，过滤，减压浓缩，干燥得22.3 g 提取物。

1.3.2 α-葡萄糖苷酶活性检测

设置1、2、20、50、100 μg/mL 5 个浓度。反应体系[9]：80 μL 磷酸钾缓冲液（pH 6.9）中依次加入10 μL α-葡萄糖苷酶（0.1 U/mL），指定浓度的样品溶液10 μL，37 ℃恒温反应10 min，加入20 μL PNPG（2.5 mmol/L），37 ℃继续恒温15 min，加入40 μL Na2CO3溶液（1 mol/L）终止反应，于405 nm 波长下测定吸光度（A）。阿卡波糖为阳性对照，同时设定空白对照（只加缓冲液）和阴性对照（只加缓冲液和酶液）。酶活性抑制率按下式计算：

1.3.3 提取物供试液的制备

1.3.3.1 非甲酯化样品

取猕猴桃根石油醚提取物18 mg，加入5 mL 二氯甲烷溶解，微孔滤膜过滤，滤液备用。

1.3.3.2 甲酯化样品

称取提取物22 mg，放入密闭瓶中，加入2 mL 氢氧化钠甲醇溶液（2%），80 ℃恒温反应0.5 h，加入1.75 mL三氟化硼甲醇溶液（15%），继续恒温反应2 min。停止加热，取出密闭瓶，加水少量，迅速冷却至室温。准确加入2 mL 正庚烷，振摇2 min，再加入氯化钠至饱和，静置分层，取上层溶液到进样瓶，备用。

1.3.4 非甲酯化样品的气相色谱条件

色谱柱为FB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）弹性石英毛细管柱，初始温度58 ℃（保留2 min），以6 ℃/min升温至310 ℃，保持10 min，运行时间54 min，气化室温度250 ℃；载气为高纯He（99.999 %），柱前压7.65 psi，载气流量1.0 mL/min，分流比20∶1，溶剂延迟时间4.0 min。

1.3.5 甲酯化样品的气相色谱条件

色谱柱为FB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）弹性石英毛细管柱，初始温度120 ℃（保留2 min），以4 ℃/min 升温至220 ℃，保持12 min，再以10 ℃/min 升温至310 ℃，保持6 min，运行时间54 min；气化室温度250 ℃；载气为高纯He（99.999%）；柱前压7.65 psi，载气流量1.0mL/min，分流比20∶1，溶剂延迟时间7.0min。

1.3.6 质谱条件

离子源为EI 源；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；电子能量70 eV；发射电流34.6 μA；倍增器电压1 518 V（甲酯化样品为1 659 V）；接口温度280 ℃；质量范围29 amu～500 amu。

1.3.7 定性定量分析

总离子流图中的各峰与Wiley275 和Nist2014 标准质谱图进行对照鉴定，用气相色谱峰面积归一化法测定各化学成分的相对质量分数。

2 结果与分析

2.1 α-葡萄糖苷酶活性

提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性见表1。

表1 猕猴桃根石油醚提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性（x±s，n=6）Table 1 Inhibitory effect on α-glucosidase of petroleum ether extracts from Actinidia chinensis radix（x±s，n=6）

由表1可知，提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率与浓度呈正相关，具有浓度依赖性，在50、100 μg/mL 浓度下可抑制作用能显著地抑制α-葡萄糖苷酶的活性。在最大考察浓度时，提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率可达（89.38±1.27）%，优于相同浓度下阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率（49.57±2.28）%。

2.2 GC-MS结果及分析

2.2.1 非甲酯化样品

非甲酯化样品的总离子流图见图1。

图1 非甲酯化样品的总离子流图Fig.1 Total ion flow chart of components in non-methyl esterification sample

对总离子流图中的信号峰进行系统检索及Nist2005 和Wiley275 标准质谱图核对，共检测出37种成分，鉴定出29 种，占流出峰总面积的93.55%，其中包括12 个酯类（77.11%）、12 个醛酮类（11.18 %）、3 个醇类（4.83%）、2 个呋喃（0.43%），各组分的鉴定结果见表2。

由表2可知，猕猴桃根石油醚提取物主要成分为（按相对含量多少排序）酯类：油酸乙酯、亚油酸乙酯、棕榈酸乙酯、油酸甲酯、硬酯酸乙酯、亚油酸甲酯，相对含量分别为37.30%、14.69%、9.50%、5.32%、4.70%、2.48 %。醛酮类：（E）-2-癸烯醛、（E，E）-2，4-癸二烯醛、（E）-2-庚烯醛、（E，Z）-2，4-癸二烯醛、（E）-2-十一烯醛、（E，E）-2，4-壬二烯醛，相对含量分别为3.46%、2.24%、1.52%、1.22%、0.85%、0.60%。醇类仅松柏醇相对含量较高，为4.21 %，其余化合物含量较低。

2.2.2 甲酯化样品结果分析

甲酯化样品的总离子流图见图2。

表2 猕猴桃根石油醚提取物挥发性成分GC-MS分析结果Table 2 GC-MS analysis of volatile oils of petroleum ether extracts from Actinidia chinensis radix

检出的24 种成分与Nist2005、Wiley275 标准质谱图库对比检索后，从中鉴定了20 种，油酸甲酯（46.01 %）、亚油酸甲酯（31.81 %）、棕榈酸甲酯（13.22 %）和硬酯酸甲酯（5.45%）4 种脂肪酸的相对含量较高，占检出所有成分的96.48%，各组分的鉴定结果如表3所示。

图2 甲酯化样品的总离子流图Fig.2 Total ion flow chart of components in methyl esterification sample

表3 猕猴桃根石油醚提取物甲酯化样品的GC-MS 分析结果Table 3 Analysis of components in methyl esterification sample

2.2.3 甲酯化与非甲酯化样品成分对比

对比表2和表3可知，油酸甲酯、亚油酸甲酯、棕榈酸甲酯、硬酯酸甲酯、辛酸甲酯为共有成分，但它们在甲酯化和非甲酯化样品中的相对含量存在差异，以油酸甲酯的差异最大，亚油酸甲酯次之。油酸甲酯、亚油酸甲酯、棕榈酸甲酯、硬酯酸甲酯、辛酸甲酯在猕猴桃根石油醚提取物中是否同时以酯类和羧酸形式存在，有待通过标准物质对照进行核实。

3 结论与讨论

α-葡萄糖苷酶抑制剂是治疗糖尿病的首选药物，与胰岛素及其他口服降糖药相比，α-葡萄糖苷酶抑制剂能有效阻止糖尿病患者餐后血糖迅速升高，使血糖维持在一定水平，减少血糖对胰腺的刺激，从而有效预防并改善糖尿病并发症的发生和发展[12]。在前期研究的基础上，对猕猴桃根石油醚提取物的α-葡萄糖苷酶抑制作用及化学组成深入分析。结果表明，猕猴桃根石油醚提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用具有浓度依赖性，在最大考察浓度时，提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率可达（89.38±1.27）%。采用GC-MS 对猕猴桃根石油醚提取物的组成进行了分析，从非甲酯化样品中鉴定出29 种成分，从甲酯化样品中鉴定出20 种成分。其中，油酸甲酯、亚油酸甲酯、棕榈酸甲酯、硬酯酸甲酯、辛酸甲酯在甲酯化和非甲酯样品中都被鉴定出。这5 种成分在猕猴桃根石油醚提取物中是否同时以酯类和羧酸形式存在，有待通过标准物质对照进行核实。

据文献报道，亚油酸及其酯类具有降血糖作用[15-16]，而降血糖作用与抑制α-葡萄糖苷酶的活性有关。结合本研究GC-MS 对猕猴桃根石油醚提取物的成分分析结果，推测猕猴桃根石油醚提取物具有降血糖作用的物质基础可能是亚油酸、亚油酸甲酯、亚油酸乙酯等成分。