超声辅助木瓜蛋白酶改性对米糠蛋白溶解性和乳化性的影响

常慧敏，杨敬东，田少君

(1.河南工业大学 粮油食品学院，郑州450001； 2.兰州润民粮油有限公司，兰州730070)

米糠蛋白中含3%～4%赖氨酸，高于水稻胚乳蛋白或其他谷物蛋白或豆类蛋白，生物效价(2.0～2.5)与牛奶中酪蛋白(2.5)相近，易于消化，不易致敏[1-2]，还具有降低胆固醇、抗动脉粥样硬化、抗疲劳和抗癌等作用。但是米糠蛋白与其他物质(如糖类，脂类)的强烈聚合，分子间通过大量的二硫键交联使得其溶解性差，进而影响其他功能特性。因此，需要采用改性技术提高米糠蛋白功能特性。

蛋白质水解产物是含有若干种氨基酸的小分子肽，具有较好的功能特性，而且其产品具备更高的营养价值。Zhang等[3]研究了碱性蛋白酶酶解经过高温稳定化及脱脂处理的米糠蛋白，Yeom等[4]研究了用两种混合酶(碱性蛋白酶和风味蛋白酶)酶解米糠蛋白。这些措施都显著提高了米糠蛋白功能性。但是对于木瓜蛋白酶酶解米糠蛋白的研究少有报道。木瓜蛋白酶是最便宜的植物来源蛋白酶之一，而且已经通过FDA批准可用于食品配方和食品加工中。木瓜蛋白酶主要作用于蛋白质亲水氨基酸赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)和苯丙氨酸(Phe)的羧基端，这样可以避免C—末端为疏水性氨基酸的苦味肽的产生。然而，传统的酶解具有水解度低和反应时间长的缺点[5]，因此许多研究采用超声处理来促进酶解反应。超声波产生的空化作用所引起的机械和热效应，可以改变蛋白质的构象和特性，从而有利于增加底物与酶之间的接触频率[6]，缩短酶反应时间。Li等[7]的研究显示，超声预处理大米蛋白可以提高碱性蛋白酶酶解反应速率和蛋白质水解度。

本研究首先利用超声对米糠蛋白进行预处理，破坏蛋白空间结构，暴露出更多的酶作用位点，再进行限制性酶解，改善米糠蛋白溶解性和乳化性。并从改性前后米糠蛋白二硫键、表面疏水性和二级结构的变化规律中，分析超声辅助酶解反应的机理。

1 材料与方法

1.1 实验材料

新鲜米糠，河南新乡八素米业有限公司；大豆油，山东万德福实业集团有限公司；木瓜蛋白酶(60万U/g)，南宁庞博生物工程有限公司；其他试剂均为化学纯或分析纯。

K1160全自动凯氏定氮仪；高速剪切乳化机，德国 FLUKO流体机械制造公司；磁力搅拌器；恒温水浴振荡器；高速离心机；722S可见分光光度计；PHS-3C 型精密酸度计；LGJ-25型冷冻干燥机；超声波细胞粉碎机；傅里叶红外光谱仪；RF-5301荧光分光光度计，日本Shimadzu公司。

1.2 实验方法

1.2.1 米糠蛋白的制备

将脱脂米糠以料液比1∶10加入蒸馏水→45℃下调pH至9.0→磁力搅拌2 h后离心20 min(4 500 r/min)→取上清液，调pH至4.5→离心20 min (4 500 r/min)后收集沉淀→用20%乙醇溶液洗两次后离心→沉淀复溶，调pH到7.0→冷冻干燥→米糠蛋白。米糠蛋白存放于-20℃备用。经凯氏定氮法测定其蛋白质含量为(60.35±0.31)%。

1.2.2 超声辅助酶改性米糠蛋白

米糠蛋白溶液在超声功率密度5 W/mL，超声时间30 min，蛋白质量浓度4 g/100 mL条件下进行预处理，然后调节pH、温度，添加一定量的木瓜蛋白酶反应一定时间，在反应过程中分别用0.1 mol/L NaOH和HCl溶液维持pH恒定，反应结束后置于85℃水浴中10 min进行灭酶，冷却后得酶解液, 一部分使用蒸馏水稀释至质量浓度为1 g/100 mL，测定其水解度(DH)、溶解性和乳化性，另一部分经过冷冻干燥用于结构的测定。

1.2.3 水解性的测定[8]

采用茚三酮比色法测定，计算公式见式(1)。

DH=酶解后游离氮含量/酶解前游离氮含量×100%

(1)

1.2.4 溶解性的测定[4]

用移液枪吸取1.2.2中10 mL酶解液于烧杯中，调节pH为7.0，室温下磁力搅拌1 h，在4 500 r/min下离心20 min。吸取4 mL上清液，用半微量凯氏定氮法测定蛋白质含量，按式(2)计算溶解性。

溶解性=水溶性氮含量/样品总氮含量×100%

(2)

1.2.5 乳化性的测定[9]

用移液枪吸取1.2.2中18 mL酶解液于50 mL离心管中，调节pH为8.0，室温下磁力搅拌1 h，在4 000 r/min下离心8 min后，加入6 mL大豆油，使用10 000 r/min的均质剪切机剪切1 min，立即从容器底部吸50 μL新鲜乳液，用0.1 g/100 mL SDS溶液稀释100倍，立即于500 nm波长下测吸光值(A0)，10 min后继续测吸光值(A10)，乳化活性指数和乳化稳定性分别按式(3)和式(4)计算。

EAI=2×2.303×A0×N/(C×φ×10 000)

(3)

ESI=A0/(A0-A10)×10

(4)

式中：EAI为乳化活性指数，m2/g;N为稀释倍数 100；C为乳液形成前蛋白溶液中蛋白质量浓度, g/mL；φ为乳液中油的体积分数，取值0.25；ESI为乳化稳定性，min。

1.2.6 游离巯基二硫键的测定[10]

采用 5，5′-二硫代二硝基苯甲酸盐比色法测定米糠蛋白总巯基和游离巯基含量，以13 600 mol/(L·cm)消光系数进行计算。总巯基与游离巯基差值的一半即为二硫键含量。

1.2.7 表面疏水性的测定[10]

取100 mg米糠蛋白溶解于0.01 mol/L pH 7磷酸盐缓冲液中，室温下磁力搅拌2 h后5 000 r/min离心20 min，收集上清液。用磷酸盐缓冲液将蛋白质量浓度稀释在0.005～0.5 mg/mL之间。取4 mL蛋白溶液，加入20 μL 0. 008 mol/L 1-苯氨基萘-8-磺酸，混合均匀，在激发波长390 nm和发射波长470 nm下测定荧光强度。以荧光强度对蛋白质量浓度作图，采用最小二乘法进行曲线拟合，直线斜率即为蛋白的表面疏水性。

1.2.8 傅里叶红外光谱分析

取2 mg米糠蛋白和200 mg KBr混合，研磨均匀后制作透明薄片，以纯KBr为参照样，室温干燥环境进行傅里叶红外光谱扫描，扫描范围400～4 000 cm-1。

对米糠蛋白的红外吸收曲线进行二级求导，光谱数据用Peakfit4.12软件进行分析。参考Wang等[11]的方法对二级结构进行鉴定：α-螺旋结构，1 650 ～1 658 cm-1；β-折叠结构，1 600～1 640 cm-1；β-转角结构，1 660～1 700 cm-1；无规卷曲结构，1 640～1 650 cm-1。

1.2.9 数据统计与分析

单项实验重复3次，结果表示为“平均值±标准差”。采用IBM SPSS Statistics 20软件对数据进行单因素方差分析，如果方差分析差异性显著(P<0.05)，则使用Duncan’s进行多重比较。采用Origin8.5软件进行图表制作。

2 结果与分析

2.1 超声预处理对酶解米糠蛋白水解度的影响

在预处理中，以乳化性和溶解性为指标，对米糠蛋白进行超声改性，确定了最佳超声条件为：超声功率密度5 W/mL，超声时间30 min，蛋白质量浓度4 g/100 mL。经超声预处理的米糠蛋白再进行限制性酶处理，固定酶解条件为酶添加量2.5 g/100 mL、pH 7、酶反应温度50℃，考察不同酶反应时间下超声预处理对米糠蛋白水解度的影响，结果见图1。

图1 酶反应时间对米糠蛋白水解度的影响

由图1可知，在相同酶反应时间内，与酶改性米糠蛋白相比，超声辅助酶改性米糠蛋白具有较高水解度，表明超声预处理促进蛋白质水解。可能因为超声产生的空化效应有助于破坏溶质-基质间的相互作用，其中涉及范德华力、氢键和分子间的偶极子吸引力，使蛋白质分子伸展，暴露出较多的酶作用位点。另外，适当的预处理与酶解相结合,往往可以使酶解产物获得更好的功能特性[12]。

2.2 超声辅助木瓜蛋白酶改性米糠蛋白

在上述最佳超声条件下，对米糠蛋白进行预处理后，进行酶改性处理，探讨木瓜蛋白酶反应条件对其溶解性和乳化性的影响。

2.2.1 酶添加量的影响

在酶反应温度50℃、pH 7、酶反应时间3 h下，考察酶添加量对米糠蛋白溶解性和乳化性的影响，结果见图2、图3。

图2 酶添加量对米糠蛋白溶解性的影响

图3 酶添加量对米糠蛋白乳化性的影响

由图2可知，酶添加量超过2.5 g/100 mL后米糠蛋白溶解性增加幅度不大。由图3可知，随着酶添加量的增加，米糠蛋白乳化活性先增大后减少，酶添加量2.5 g/100 mL时达到最大，乳化稳定性则不断升高。这可能因为酶添加量增大，蛋白质分子与酶接触频率增加，进而被水解成更多的小分子肽，而小分子肽能够快速溶解并吸附在油水界面上，形成黏弹性保护膜，从而提高米糠蛋白的乳化活性。但当酶添加量到一定程度后，小分子肽被分解为更低相对分子质量的肽，它们可能不具有足够的两亲性以表现出良好的乳化性质[13]，使得乳化活性降低。而水解后的小分子肽增加了离子化基团的数量和分布，在形成的乳状液中液珠间吸引作用小于排斥作用，二者不易聚集，并且蛋白质疏水基团外露，液珠中蛋白质分子与油滴的吸引作用增强，乳化稳定性提高[14]。虽然酶添加量较高时乳化稳定性较好，但乳化活性降低，而且酶解成本增加。因此，选择酶添加量2.5 g/100 mL。

2.2.2 酶反应时间的影响

在酶反应温度50℃、pH 7、酶添加量2.5 g/100 mL下，考察酶反应时间对米糠蛋白溶解性和乳化性的影响，结果见图4、图5。

图4 酶反应时间对米糠蛋白溶解性的影响

图5 酶反应时间对米糠蛋白乳化性的影响

由图4可知,酶解3 h后米糠蛋白溶解性增加不显著。由图5可知，当酶反应时间延长，米糠蛋白乳化活性先增大后减小，在3 h达到最大。而乳化稳定性不断升高。这与Bandyopadhyay等[9]研究结果一致。考虑到酶反应时间过长乳化活性降低及过度水解引起营养价值的改变[15]，选择酶反应时间3 h。

2.2.3 酶反应pH的影响

在酶反应温度50℃、酶反应时间3 h、酶添加量2.5 g/100 mL下，考察酶反应pH对米糠蛋白溶解性和乳化性的影响，结果见图6、图7。

由图6、图7可知，米糠蛋白溶解性、乳化活性和乳化稳定性在pH 5～7时增加，pH 7～8时降低。这可能因为在适宜pH下，酶的活力最高，水解充分，二者达到最高。当pH 8～9时米糠蛋白溶解性及乳化性出现了增大现象，可能因为米糠蛋白在碱性条件下发生了水解，提高了其溶解度和乳化性，但pH较高时会破坏或改变必需氨基酸，降低蛋白质的质量[4]。因此，选择酶反应pH 7。

图6 酶反应pH对米糠蛋白溶解性的影响

图7 酶反应pH对米糠蛋白乳化性的影响

2.2.4 酶反应温度的影响

在酶反应pH 7、酶添加量2.5 g/100 mL、酶反应时间3 h下，考察酶反应温度对米糠蛋白溶解性和乳化性的影响，结果见图8、图9。

图8 酶反应温度对米糠蛋白溶解性的影响

图9 酶反应温度对米糠蛋白乳化性的影响

由图8可知，在酶反应温度范围内米糠蛋白溶解性变化幅度不大。由图9可知，米糠蛋白乳化活性在40～50℃时增加，50～55℃时降低。乳化稳定性在40℃时最大，而55℃最小。这可能因为温度影响了酶活。55℃后继续升高温度，米糠蛋白的乳化活性及乳化稳定性又有增高趋势，可能因为米糠蛋白里混有的淀粉发生了糊化[4]，增加了液体的黏度，使得二者增高。虽在低温下乳化稳定性较高，考虑到温度过低，酶活较弱，降低了乳化活性和延长了酶解时间，因此确定酶反应温度为50℃。

2.2.5 验证实验

根据单因素实验结果对米糠蛋白改性做综合的验证实验，实验共分为3组，各组的工艺参数见表1，并对比了改性前后米糠蛋白溶解性和乳化性，结果见表2。

表1 验证实验参数

注：超声预处理参数为超声时间30 min，超声功率密度5 W/mL，蛋白质量浓度4 g/100 mL。

表2 改性前后米糠蛋白溶解性和乳化性的对比

由表2可知，超声辅助酶改性米糠蛋白溶解性比米糠蛋白提高了207.3%，可能因为米糠蛋白中不溶性蛋白质被酶解成可溶性小分子肽。乳化活性提高了54.94%，是由于米糠蛋白具有较低的表面疏水性，不利于其与脂质之间的相互作用[16]，而酶解后，结构展开，疏水基团暴露于表面，提高了其在油水界面上的吸附作用，从而较易形成内聚性膜。但乳化稳定性降低了38.25%，可能因为米糠蛋白被水解成小分子的多肽，不能较好地包裹在油滴表面，降低了蛋白膜的稳固性[17]。但是，与酶改性米糠蛋白相比，超声预处理使其溶解性、乳化活性及乳化稳定性均有所提高。

2.3 改性前后米糠蛋白二硫键含量(见表3)

表3 改性前后米糠蛋白二硫键含量

二硫键对于维持蛋白质的空间结构具有重要作用，其含量的增加表明蛋白质发生了交联，而含量减少表明蛋白质主干结构被破坏[18]。由表3可知，超声改性米糠蛋白二硫键含量减小，这与Zhou[19]等研究超声预处理小麦胚芽蛋白的结果一致。可能因为超声引起的剪切作用促使蛋白质发生了去折叠。另外，超声辅助酶改性米糠蛋白二硫键含量减小效果比单独酶法改性明显，可能因为其多肽链更加伸展，进而使更多的包埋于蛋白质内部的亲水和疏水基团暴露出来，提高了溶解度和乳化性。

2.4 改性前后米糠蛋白表面疏水性(见表4)

表4 改性前后米糠蛋白表面疏水性

由表4可知，超声改性米糠蛋白表面疏水性增加，这与Jiang等[20]研究超声处理黑豆蛋白的结果一致。表明更多的疏水区域暴露于蛋白表面，可能由于超声打开蛋白质空间结构，进而促使酶更容易作用于蛋白质上，导致水解度提高，引起表面疏水性增加，促进其在溶液中扩散以及在油水界面上快速分布，增强乳化性，这与Cheetangdee[21]的研究结果一致。

2.5 改性前后米糠蛋白二级结构变化(见表5)

表5 改性前后米糠蛋白二级结构 %

β-折叠和无规则卷曲含量增加，β-转角含量下降，表明蛋白质变得更加疏松与伸展[22]。从表5可知，超声改性使米糠蛋白这种结构发生改变，进而使得酶与蛋白质分子更易于接近，从而提高酶解程度，促使溶解性增大。同时蛋白酶解后形成的小分子肽会促进α-螺旋结构向无规卷曲结构转变，无规则卷曲可以为蛋白质分子提供柔性结构单元。而柔性越大，乳化性越好[23]。

3 结 论

米糠蛋白在超声功率密度5 W/mL、超声时间30 min、蛋白质量浓度4 g/100 mL条件下预处理后，进行酶解反应，当酶添加量2.5 g/100 mL、酶反应时间3 h、pH 7、酶反应温度50℃时，超声辅助酶改性米糠蛋白溶解性为89.61%，比未改性的提高了207.3%，乳化活性指数为19.29 m2/g，比未改性的提高了54.94%，乳化稳定性为50.00 min，比未改性的降低了38.25%。由于超声促进酶催化位点暴露，所以与酶改性米糠蛋白相比，超声辅助酶改性米糠蛋白的溶解性和乳化性均得到提高。

米糠蛋白经超声辅助酶改性后，二硫键含量减少，表明蛋白质多肽链得到伸展，表面疏水性升高。β-折叠和无规则卷曲含量增大，α-螺旋和β-转角含量减小，说明蛋白质结构发生伸展和重组，分子柔性增强。这些结构上的变化，改善了米糠蛋白的溶解性和乳化性。