响应面优化超声-酶辅助强化油橄榄叶多糖的提取

原姣姣，陈锦璇，张 帆，涂军令，秦贯丰，李 冰

(1.东莞理工学院 化学工程与能源技术学院，广东 东莞 523808； 2.华南理工大学 食品科学与工程学院，广州 510640)

油橄榄(OleaeuropaeaL.)，属木犀科木犀榄属常绿乔木，是世界著名的木本油料树种之一[1]。橄榄油由成熟的油橄榄鲜果直接冷榨而成，较大限度地保留了其原有的营养价值，具有抗衰老、预防心脑血管疾病、抗肿瘤、促进骨骼和神经系统发育等多种功能[2-3]。由于对油橄榄叶有效成分的认知缺乏，油橄榄叶被丢弃、埋藏或焚烧，造成资源浪费和环境负担。事实上，油橄榄叶富含多种活性成分，如橄榄苦苷[4]、羟基酪醇[5]等多酚、黄酮和多糖等。研究发现植物多糖具有抗肿瘤[6-7]、降血脂[8]、抗氧化、抗疲劳[9]等作用。

目前，植物多糖的提取方法有热水浸提法、碱浸提法、酶解法、微波提取法、超声提取法。传统提取方法因简单安全在工业上被广泛应用，但耗时较长，效率低。超声提取能够破坏细胞壁，增加溶剂穿透力，高效快速提取细胞内物质，提高了传质速率，对提取物的结构和活性不产生影响，从而提高提取率和缩短提取时间[10-12]。为此，本文利用超声物理场和酶解相结合，探讨油橄榄叶多糖的提取以及深加工新的手段和方法，旨在为植物资源在食品、医药领域的高值化利用提供基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

油橄榄叶，购于甘肃陇南市武都种植区，筛选出无任何机械损伤、病虫害的新鲜油橄榄叶，对其进行清洗，真空干燥后粉碎，过40目筛，制备成粒度大小均匀的油橄榄叶粉末。

无水乙醇、石油醚(60～90℃)、苯酚、浓硫酸、葡萄糖，均为分析纯，天津市大茂化学试剂厂；纤维素酶(BIOSHARP®)；果胶酶(BIOSHAR®)。

1.1.2 仪器与设备

723可见分光光度计，ME204E电子天平(梅特勒-托利多公司)，DZF-6090真空干燥箱，RE-52AA旋转蒸发器，TG20-WSI离心机，JP-040S超声波清洗机，HH-S4恒温水浴锅，DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器。

1.2 实验方法

1.2.1 油橄榄叶多糖的提取

基于多糖成分大多溶于水的特性，本研究采用石油醚和乙醇溶液热回流预处理油橄榄叶，以去除油橄榄叶中脂溶性成分和醇溶性成分，为油橄榄叶多糖提取提供便捷。具体提取工艺流程为：油橄榄叶粉末→石油醚热回流(60℃，1 h)→抽滤→70%乙醇热回流(70℃，1 h)→抽滤→乙醇洗两次→超声提取/酶提取→抽滤→浸膏→醇沉过夜→离心干燥→油橄榄叶多糖。

1.2.2 多糖的测定

采用苯酚硫酸法[13]。硫酸可以使多糖水解成单糖，然后与苯酚形成橙黄色物质，使用分光光度计在波长490 nm测定其吸光度。通过葡萄糖标准曲线计算相应的多糖质量浓度。

1.2.2.1 葡萄糖标准曲线的绘制

取8支干净的试管，分别加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 100 μg/mL的葡萄糖溶液，定容至1.5 mL，再加入0.5 mL 6%的苯酚溶液，充分振荡摇匀后缓慢逐滴加入浓硫酸3.0 mL，摇匀后静置30 min，以质量浓度为0的葡萄糖溶液作为空白对照进行调零，在最大吸收波长490 nm测定不同质量浓度的葡萄糖溶液的吸光度。以葡萄糖质量浓度(x)为横坐标，吸光度(y)为纵坐标，利用Origin软件绘制标准曲线，并用线性拟合求得回归方程为y=0.07x+0.06，在0～20 μg/mL范围内有良好的线性关系。

1.2.2.2 待测样品多糖的测定

将提取的多糖称取0.01 g，溶解于蒸馏水中，定容到100 mL，取0.5 mL，按1.2.2.1实验步骤，测出溶液的吸光度并根据回归方程计算待测溶液的多糖质量浓度。按下式计算多糖提取率[14]。

多糖提取率=cNVf/m×100%

式中：c为多糖质量浓度，g/mL；N为稀释倍数；V为定容体积，mL；f为校正系数，取值0.9；m为样品质量，g。

2 结果与分析

2.1 酶提取单因素实验

2.1.1 纤维素酶与果胶酶质量比对油橄榄叶多糖提取率的影响

称量2 g油橄榄叶干粉，在不同质量比的纤维素酶与果胶酶添加量0.6%、液(水，下同)料比20∶1、酶解温度30℃、酶解时间2 h条件下进行提取，提取的多糖溶液过滤后，滤液旋转蒸发至膏状，然后加入50 mL无水乙醇进行醇沉过夜，离心干燥，计算多糖提取率，结果见图1。

图1 纤维素酶与果胶酶质量比对多糖提取率的影响

由图1可知，纤维素酶对油橄榄叶多糖提取的影响大于果胶酶，在纤维素酶与果胶酶质量比为 2∶1 时油橄榄叶多糖提取率最高，因此最优的纤维素酶与果胶酶质量比选择2∶1。

2.1.2 酶解温度对油橄榄叶多糖提取率的影响

称量2 g油橄榄叶干粉，在纤维素酶与果胶酶质量比2∶1条件下，改变酶解温度，其他条件及操作同2.1.1，考察酶解温度对多糖提取率的影响，结果见图2。

图2 酶解温度对多糖提取率的影响

由图2可知，当酶解温度在20～50℃时，多糖提取率随着酶解温度的升高而增加。当酶解温度超过50℃后，多糖提取率反而会下降，这是因为温度较高时酶活性降低，酶促反应减弱，多糖提取率也随之降低。因此，最佳酶解温度选择50℃。

2.1.3 酶解时间对油橄榄叶多糖提取率的影响

称量2 g油橄榄叶干粉，在酶解温度30℃条件下，改变酶解时间，其他条件和操作同2.1.2，考察酶解时间对多糖提取率的影响，结果见图3。

图3 酶解时间对多糖提取率的影响

由图3可知，当酶解时间在1～3 h时，多糖提取率随着酶解时间的延长而增加。当酶解时间超过3 h时，多糖提取率基本不变。因此，从时间效益考虑最佳酶解时间选择3 h。

2.2 超声提取单因素实验

2.2.1 液料比对油橄榄叶多糖提取率的影响

称量2 g油橄榄叶干粉，在超声体积功率密度120 W/L、超声时间30 min条件下，改变液料比，对油橄榄叶多糖进行提取，提取的多糖溶液过滤后，滤液旋转蒸发至膏状，然后加入50 mL无水乙醇进行醇沉过夜，离心干燥，分析计算多糖提取率，结果见图4。

由图4可知，当液料比在10∶1～30∶1时，多糖提取率随着液料比的增加而增加。当液料比超过30∶1时，多糖提取率有所下降。因此，从生产效益考虑最佳液料比选择30∶1。

图4 液料比对多糖提取率的影响

2.2.2 超声时间对油橄榄叶多糖提取率的影响

称量2 g油橄榄叶干粉，在液料比20∶1条件下，改变超声时间，其他条件及操作同2.2.1，考察超声时间对多糖提取率的影响，结果见图5。

图5 超声时间对多糖提取率的影响

由图5可知，当超声时间在10～20 min时，多糖提取率随着超声时间的延长而增加。当超声时间超过20 min时，多糖提取率随着超声时间的延长而减少。因此，从生产效益考虑最佳超声时间选择20 min。

2.3 超声-酶辅助法不同提取顺序的影响

根据单因素实验结果，确定：酶提取油橄榄叶多糖的条件为2 g油橄榄叶干粉、纤维素酶与果胶酶质量比2∶1、酶添加量0.6%、液料比30∶1、酶解温度50℃、酶解时间3 h；超声提取油橄榄叶多糖的条件为2 g油橄榄叶干粉、液料比30∶1、超声体积功率密度120 W/L、超声时间20 min。考虑到酶解3 h时油橄榄叶多糖提取率达到2.75%左右，超声20 min时多糖提取率可达3.85%左右，超过20 min多糖提取率会降低，因此选择超声-酶辅助法同时进行时提取时间为20 min。超声-酶辅助法不同提取顺序对油橄榄叶多糖提取率的影响见表1。

表1 提取顺序对多糖提取率的影响

注：相同小写字母表示没有统计学差异(Tukey检验，P>0.05)，不同小写字母表示有差异显著性(Tukey检验，P<0.05)。

由表1可知，先酶解后超声时多糖提取率最高，这是由于在酶解过程中利用酶的生物降解作用，分解了油橄榄叶的细胞壁结构，结合超声作用可以加速多糖的溶出。3种提取顺序所得的多糖提取率存在显著性差异(P<0.05)，说明这3种提取方式对多糖的提取率有很大区别。因此，先酶解后超声的提取方式选择为最佳工艺。

2.4 超声-酶辅助法提取油橄榄叶多糖的响应面优化实验

根据单因素实验结果，结合各因素对多糖提取率的变化范围以及拐点波动大小等影响，综合考虑选取3个因素，即液料比(A)、酶解温度(B)和超声时间(C)作为变量，多糖提取率(Y)为响应值进行超声-酶辅助提取油橄榄叶多糖的响应面设计，并对实验结果进行统计分析，结果见表2、表3。

表2 响应面设计因素水平

表3 响应面设计及实验结果

利用Design-Expert软件拟合表3中的数据，可以得到多糖提取率回归方程为：Y=4.39+0.11A+0.25B-0.056C+0.035AB+0.020AC-0.017BC-0.046A2-0.34B2-0.18C2。

对回归方程进行方差分析，结果见表4。

由表4可知，回归模型P<0.001，证明该回归模型达到极显著的水平，模型相关系数R2为0.991 5，表明99.15%以上的实验数据可以通过该数学模型来解释，说明回归方程可靠性较高。失拟项P>0.05，表明失拟项差异不显著，残差是由随机误差引起的。方差分析结果表明，该模型对油橄榄叶多糖提取率的实际值与预测值有很好的拟合度，可用于分析、预测油橄榄叶多糖的最佳提取工艺条件。另外，3个因素对多糖提取率影响的强弱为:酶解温度最大，液料比次之，超声时间最小。一次项A、B、C，二次项B2、C2对实验结果影响极显著(P<0.01)；交互项AB、AC、BC，二次项A2对实验结果影响不显著(P>0.05)；这说明实验因素与多糖提取率之间没有简单的线性关系，而是非线性关系[15]。

表4 方差分析

模型预测最佳提取工艺条件为:液料比40∶1，酶解温度54.24℃，超声时间18.78 min。在最佳提取条件下，油橄榄叶多糖的提取率为4.52%。因为实际操作具有局限性，各因素分别取整，修正为：液料比40∶1，酶解温度54℃，超声时间19 min。在最佳提取条件下进行3次验证实验，得到油橄榄叶多糖提取率的平均值为4.50%。实验结果稳定，重现性较好，和模型预测值的误差仅为0.02个百分点，说明该模型具有有效性。

2.5 油橄榄叶细胞壁微观结构形貌变化

SEM作为一种有效的工具能够用来观察油橄榄叶提取多糖前后样品表面的形态变化。油橄榄叶原料、水提取多糖后、超声-酶辅助提取多糖后油橄榄叶的扫描电镜图如图6所示。

由图6可见，与原料相比，经水提取、超声-酶辅助提取的样品微观结构都发生了明显变化。油橄榄叶的细胞壁表面整齐，并且细胞壁相邻孔洞之间排列紧密。水提取后的油橄榄叶细胞壁表面已经有些松散，外形比较粗糙，但结构并未被破坏。经超声-酶辅助提取后油橄榄叶的细胞壁表面结构破坏严重，有大量的孔洞出现，并且相邻孔洞之间排列疏松。这是因为超声和酶解相互作用，导致细胞壁结构发生改变。油橄榄叶细胞壁结构的改变有利于细胞内的成分释放出来，使提取过程中传质阻力大大减小，提高了传质速率以及多糖的提取率。Zhang等[16]对比了超声辅助酶解方法提取银杏叶前后的细胞结构，同样发现细胞壁结构发生了很大的改变，提高了提取效率。

图6 不同样品的扫描电镜图

3 结 论

采用超声-酶辅助提取油橄榄叶中的多糖，根据单因素实验结果选取对油橄榄叶多糖提取率影响较大的液料比、酶解温度、超声时间3个因素进行响应面设计实验，并建立了油橄榄叶多糖提取率的二次多项式数学模型，经验证表明该数学模型具有有效性，可在实际生产中进行预测。实验确定采用先酶解再超声的方式提取油橄榄叶多糖的效果比较好，并确定最佳工艺条件为：纤维素酶与果胶酶质量比2∶1，酶添加量0.6%，液料比40∶1，酶解温度54℃，酶解时间3 h，超声体积功率密度120 W/L，超声时间19 min。在最佳条件下，油橄榄叶多糖提取率可达4.50%。经扫描电镜(SEM)对不同提取方法的样品微观结构形态进行观察，结果说明超声-酶辅助提取过程使油橄榄叶细胞壁严重破坏，这种破壁作用可以使提取过程中传质阻力大大减小，提高了传质速率和活性物质多糖的提取率。该研究结果不仅为油橄榄叶多糖的高效提取提供了工艺路线和工艺参数的数据支撑，而且对一般植物多糖的提取具有参考价值。