hUC-MSCs下调HIF-1α及VEGF表达对NAFLD大鼠肝脏损伤的作用

王文清 易文城 林拥华

非酒精性脂肪性肝病（non alcohol fatty liver disease，NAFLD）是指肝脏内脂肪浸润超过5%，排除过量饮酒、自身免疫、病毒感染和药物性损伤的疾病。近年NAFLD发病率呈持续攀升趋势，已成为继慢性病毒性肝炎危害公共健康的第二大肝病[1-2]。缺氧诱导因子 1α（hypoxia inducible factor-1，HIF- 1α）是目前发现的唯一在机体缺氧状态下发挥活性作用的重要调节因子，能够与血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等 靶基因中的缺氧反应元件结合并促进其转录和表达，从而调控机体各组织缺氧预适应。已有研究证实HIF-1α调控VEGF信号通路与机体诸多组织损伤中的发生和发展密切相关[3]，但其对NAFLD肝组织损伤的作用鲜见报道。为此，本研究通过高糖高脂饲料喂养SD大鼠建立NAFLD模型，探讨脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs）介导 HIF-1α/VEGF 通路对NAFLD肝脏结构及功能的影响。

材料与方法

一、材料

1.实验动物：21只5周龄清洁级雄性SD大鼠，由上海斯莱克实验动物有限责任公司订购，按照实验动物管理条例规定的环境中进行饲养，适应性饲养7 d。

2. hUC-MSCs：本实验选用第 3 ～ 7 代 hUCMSCs。剪取足月产妇脐带基质组织块制备hUC- MSCs，胶原酶Ⅳ消化组织块，取悬液，离心、萃取，沉淀，胰蛋白酶消化，过滤，取细胞滤液，离心、细胞计数，接种、常规培养及传代均选用无血清低糖DMEM培养基。

二、方法

1.动物分组及干预：21只大鼠随机分为7只正常对照组（NC组）和14只NAFLD造模组。正常组大鼠给予常规饲料喂养，造模组大鼠给予高糖高脂饲料喂养8周。14只造模大鼠再次随机分为NAFLD模型对照组（MC组）；hUC-MSCs治疗组（MC+hUC-MSCs组）；两组大鼠继续喂养高糖高脂饲料，其中，MC+hUC-MSCs组每两周尾静脉注射含 hUC-MSCs数目为 10×106个的培养液 100 μl，共干预8周。NC组和MC组同期尾静脉注射不含hUC-MSCs培养液 100 μl。

2.一般指标观察、采集血清和肝脏组织标本：密切观察并记录大鼠饮食情况、精神状及活动状态和体重等一般状况；各组大鼠干预8周处死，留取血清标本及肝脏组织标本并按适宜方法保存。肝指数（%）=（肝湿重／体重）×100%。

3.血清指标检测：谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、空腹血糖（FPG）和空腹胰岛素（FINS）；计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）=FPG×FINS/22.5（FPG：mmol/L，FINS：mU/L）。

4. HE染色光镜观察大鼠肝脏组织形态：按照美国国立卫生研究院NASH临床研究网病理工作组2011年制定的NAFLD活动度积分（NAS）评估指南，对各组大鼠进行NAS评定。NAS积分评定标准为：（1）肝细胞呈现脂肪变性：0分（＜ 5%）；1分（5%～ 33%）；2分（34%～ 66%）；3分（＞ 66%）。（2）肝小叶内炎症程度（以20倍光镜下计数坏死灶）：0分，无；1 分（＜ 2个）；2分（2 ～ 4个）；3分（＞4 个）。（3）肝细胞呈现气球样变性：0分，无；1分，少见；2分，多见。

图1 光镜下观察各组大鼠治疗8周肝脏组织病理改变（HE染色，×200）

5. Western Blot法检测组织蛋白表达：取大鼠肝脏组织经PBS漂洗，组织裂解液提取总蛋白，聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶电泳，将蛋白质转移至PVDF膜，封闭后加 VEGF抗体（1:1000）、抗 HIF-1α抗体（1:1000）、GAPDH（1:5000）过夜，TBCT漂洗再加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育，TBGT漂洗，加入ECL暗室曝光，用Fluor-s凝胶系统分析蛋白条带。

三、统计学分析方法

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，ALT、AST和HOMA-IR用x± s表示，多组间比较采用单因素方差分析，相关分析选用pearson。以P＜ 0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、比较各组大鼠治疗8周ALT、AST和HOMA-IR

与 NC组比较，MC组大鼠 ALT、AST和HOMA-IR均升高（P＜ 0.05）；与MC组比较，MC+hUC-MSCs组大鼠ALT、AST和HOMA-IR均有不同程度的降低（P＜ 0.05，表1）。

表1 各组大鼠治疗8周ALT、AST和HOMA-IR比较（± s）

表1 各组大鼠治疗8周ALT、AST和HOMA-IR比较（± s）

注：与 NC 组比较，aP ＜ 0.01；与 MC组比较，bP ＜ 0.01

分组 鼠数（只）ALT（U/L） AST（U/L） HOMA-IR NC 组 741.1±5.951.7±5.21.93±0.22 MC 组 7153.9±7.1a169.8±15.9a23.20±2.63a MC+hUC-MSCs组 790.7±8.1ab110.0±13.1ab 8.43±1.39ab F值 445.03162.20280.40 P 值 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01

二、比较各组大鼠治疗8周肝脏组织病理改变及评定NAS积分

HE染色大鼠肝脏组织，光镜下可见NC组大鼠肝细胞形态正常，细胞核大而圆，肝小叶呈放射状排列；MC组大鼠肝细胞呈现弥漫性脂肪变性，较多细胞核变形或消失，肝小叶排列不齐伴炎症细胞浸润；MC+hUC-MSCs组大鼠肝组织病理明显改善，肝细胞脂肪变性程度减轻，脂滴空泡明显减少，炎症反应减轻（图1）。治疗8周计算各组大鼠NAS积分显示：与NC组比较，MC组大鼠NAS积分显著增高；与MC组比较，MC+hUC-MSCs组大鼠NAS积分降低[（0.42±0.23）分vs（9.15±0.41）分、（5.15±0.29）分，P＜ 0.05]。

三、各组大鼠治疗8周Western Blot法免疫组化法检测肝脏组织HIF-1α和VEGF蛋白表达

与NC组比较，MC组大鼠HIF-1α和VEGF蛋 白 表达 均 增 高（P＜ 0.05）；与 MC 组 比 较，MC+hUC- MSCs组大鼠HIF-1α和VEGF蛋白表达均降低（P＜ 0.05）（图 2，3）。

图2 各组大鼠治疗8周Western Blot法检测肝脏组织VEGF、HIF-1α和GAPDH蛋白表达水平

图3 各组大鼠治疗8周Western Blot法检测肝脏组织HIF- 1α和VEGF相对蛋白表达

四、相关分析

单因素相关分析显示大鼠肝脏组织HIF-1α表达与大鼠胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白以及HOMA-IR指数均呈正相关（r值分别为0.783、0.751、0.837、0.892，P均 ＜ 0.05），而与高密度脂蛋白呈负相关（r= -0.319，P＜ 0.05）。而且，大鼠肝脏组织NAS评分与肝脏组织HIF-1α、VEGF表达呈正相关（r值分别为 0.901、0.874，P均 ＜ 0.05），而大鼠肝脏组织HIF-1α与VEGF的表达呈正相关（r=0.916，P＜ 0.05）。

讨 论

目前NAFLD发病机制虽然尚未完全阐明，但经典“两次胰岛素抵抗打击”学说依然是其致病的主要环节[6]，即首次胰岛素抵抗打击可造成肝细胞脂质沉积，持续过量沉积的脂质可进一步加剧胰岛素抵抗，进而促使肝脏脂质过氧化[7]，因此，高糖高脂饲料喂养SD大鼠是近年研究NAFLD常用的较理想方法。本研究采用此造模方式，与文献报道的一致，观察到NAFLD模型大鼠ALT、AST和HOMA-IR增高等肝功能异常，肝脏组织HE染色在光镜下可见肝细胞呈现弥漫性脂肪变性，较多细胞核变形或消失，肝小叶排列不齐伴炎症细胞浸润以及NAS积分增加等改变。

慢性缺氧可能是引起NAFLD的一个重要因子。HIF-1定位于细胞染色体14921-924，由两个亚基α和β所组成，是细胞对氧浓度改变自适应反应中重要调节因子。其中HIF-1α发挥主要生物学作用。在常氧状态下，通过蛋白的脯氨酰羟化和泛素化而降解；在缺氧条件下，泛素化水平被降解而增加HIF-1α表达，HIF-1α表达增多，在胞核中与HIF- 1β结合形成异二聚体即可与缺氧反应元件结合启动转录[4]。研究认为NAFLD存在两次胰岛素抵抗打击，导致活性氧生成增多。一方面，抗氧化酶减少且活力下降，另一方面，氧化酶增多且活性增强，致使NAFLD肝脏组织氧化/抗氧化系统失衡，导致氧化反应损伤。此外，NAFLD因受胰岛素抵抗打击，还存在低度炎症性反应，NF-кB活性增加，NF-кB两种亚基P50和P65均可识别并与HIF-1α启动子结合，促进HIF-1α表达增加，活化缺氧反应通路，使红细胞携氧能力下降，肝脏氧气不易扩散至组织中，毛细血管基底膜增厚，以及血液成分发生改变，从而致使NAFLD肝脏组织缺氧和缺血。此外，HIF-1α的上调会致使血管内皮生长因子VEGF等促进对诱使肝脏发生纤维化的相关细胞因子表达。VEGF不仅能特异性地直接作用于血管内皮细胞促使新生血管形成，而且能使内皮血管间质胶原酸表达，促进肝脏纤维化发生[5]。本研究利用Western Blot法证实NAFLD大鼠肝脏组织HIF-1α和VEGF表达较正常大鼠明显增加，相关关系分析还显示肝脏HIF-1α和VEGF不仅与大鼠HOMA- IR评分呈正相关，而且大鼠肝脏组织NAS评分与肝脏组织HIF-1α、VEGF表达呈正相关，大鼠肝脏组织HIF-1α与VEGF的表达呈正相关。提示HIF-1α/VEGF通路与肝脏组织结构、功能改变关系密切相关。

越来越多的研究结果显示干细胞具有维持机体器官组织炎症免疫稳态等多重作用。干细胞不仅能激活B细胞、T细胞和NK细胞活性，而且能通过调控白细胞介素-6和转化生长因子-β等多种炎症因子，进而调节机体组织炎症稳态[6]。基础研究结果显示hUC-MSCs可归巢至受损的肝脏组织，分泌肝细胞生长因子、血管内皮生长因子和转化生长因子-β，改善内源性肝细胞再生、抑制凋亡，从而改善受损肝脏组织微环境[7]。间充质干细胞尚能通过减少白细胞介素表达和活性，降低P38促分裂原活性蛋白酶和C-Jun氨基末端激酶活化，促进肝细胞增殖、抑制肝细胞变性及凋亡从而改善CC4诱导的小鼠肝脏损伤[8]。此外，干细胞还具有旁分泌效应而促进肝细胞再生[9]。

在本研究中，经hUC-MSCs治疗8周NAFLD大鼠ALT、AST和HOMA-IR均降低，肝脏组织病理改变明显改善，肝细胞脂肪变性程度减轻，脂滴空泡明显减少，炎症反应减轻，NAS积分明显降低。同时肝脏组织HIF-1α与VEGF的表达降低。而且相关关系分析显示大鼠肝脏组织NAS评分与肝脏组织HIF-1α和VEGF表达呈正相关，提示hUC- MSCs通过下调HIF-1α/VEGF表达可能是保护NAFLD肝脏病变的作用机制之一。

综上所述，对在NAFLD发生发展过程中进行动态监测hUC-MSCs对HIF-1α及VEGF表达的影响，将对未来应用hUC-MSCs防治NAFLD具有临床应用价值。