益生菌Probio-Fit®联合二甲双胍对Ⅱ型糖尿病患者疗效及肠道菌群结构的影响

陈 晔 王彦杰 尤利军 靳 昊 张 丹 李冬梅 张和平*

（1 内蒙古农业大学 乳品生物技术与工程教育部重点实验室 呼和浩特010018）

2 内蒙古自治区人民医院 呼和浩特010018）

3 呼伦贝尔市海拉尔区人民医院 内蒙古呼伦贝尔021000）

Ⅱ型糖尿病（T2D）是一种流行性代谢疾病，随着人们生活方式的改变，该病患者在近几十年来急剧增加，并逐渐趋于年轻化[1]。目前已成为全世界重要的公共卫生问题之一。同时T2D 代谢异常可导致多种严重并发症，如糖尿病视网膜病变、心血管疾病、肾病等[2]，给家庭和社会带来沉重负担。

之前很多研究认为T2D 主要是由胰岛素抗性和β 细胞功能紊乱所引起，然而随着肠道菌群研究的深入，发现肠道菌群紊乱也会导致T2D 的发生、发展[3]。宏基因组关联分析显示T2D 患者肠道菌群出现失调，部分丁酸盐产生菌减少，大量条件致病菌增多，厚壁菌门和梭状芽胞杆菌纲显著降低[4-5]。鉴于此，患者肠道菌群组成及变化可以作为除临床指标外评价T2D 患者健康状态及药物治疗效果的另一项重要指标。

二甲双胍作为一种双胍类药物，是当前治疗初期T2D 的首选药物之一，它具有较好的降低肝脏糖异生及抑制肠道对糖吸收的作用[6]。此外，Naito 等[7]发现高脂饮食的肥胖小鼠摄入益生菌Lactobacillus casei Shirota 后，胰岛素抗性得到改善；补充Bifidobacteria 可改善胰岛素抗性，促进血糖浓度降低[8]；饮用益生菌酸奶可显著降低血糖浓度和糖化血红蛋白浓度（HbAlc）[9]。上述研究均表明，摄入益生菌或益生菌发酵产品对于改善T2D患者健康状态具有一定的作用。由此，本文提出疑问，即：将益生菌与二甲双胍联合治疗T2D 能否取得比单独使用二甲双胍更好的治疗效果？

基于上述问题，本研究选取诊断为T2D 的患者，以服用安慰剂联合二甲双胍作为安慰剂组，以服用益生菌Probio-Fit®联合二甲双胍作为益生菌组，通过测定患者治疗前、后的临床指标，分析粪便肠道菌群结构和菌群代谢通路的差异和变化，评估两种方法的疗效。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

罗氏COBAS C501 全自动生化分析仪，美国Roche Diagnostics 公司；Applied biosystems PCR仪，基因有限公司；ND-1000 型微量紫外分光光度计，美国生命技术公司；HWS24 型恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司；AR2202CN 电子天平，奥豪斯仪器上海有限公司；Eppendorf 5810R 高速冷冻离心机，德国Eppendorf 公司；ML-30L 型全自动高压蒸汽灭菌器，日本HIRAYAMA 公司。

粪便宏基因组DNA 试剂盒 （QIAamp Fast DNA Stool Mini kit），德国QIAGEN 公司；南芯粪便保护液试剂盒（longseegen stool storage kit），广东南芯医疗科技；Illumina HiseqXten 测序平台，美国Illumina 公司。

1.2 试验设计

纳入本研究的10 名Ⅱ型糖尿病志愿者中，3名为女性，7 名为男性，具体志愿者信息如表1所示。随机分为益生菌组（6 人）、安慰剂组（4 人），进行为期90 d 的益生菌或安慰剂干预。益生菌组实验人员在标准二甲双胍治疗（二甲双胍肠溶片，拜耳公司产品，商品名：格华止）前提下，加服益生菌Probio-Fit®2 g（1.5×1010CFU/g）。益生菌Probio-Fit®中含有3 种本实验室自主筛选的优良益生菌，分别为干酪乳杆菌张（Lactobacillus casei Zhang），植物乳杆菌P-8（Lactobacillus plantarum P-8）和动物双歧杆菌V9（Bifidobacterium animalis subsp.lactis V9），活菌数均为5×109CFU/g。安慰剂组患者在标准二甲双胍治疗基础上，加服安慰剂2 g。

表1 志愿者基本信息Table1 The information of volunteers

1.3 方法

1.3.1 血液及粪便样品采集 采集志愿者0 d 和90 d 血液样本和粪便样本，血液样本采集到真空采血管中，离心后取血清测定与T2D 相关的血液指标。粪便样品使用一次性粪便采样器收集，并用干冰冷藏寄回内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，于-80 ℃冰箱暂存备用。

1.3.2 临床指标测定 将采集后的血液样本离心后收集血清，使用罗氏COBAS C501 全自动生化分析仪测定空腹血糖 （GLU）、 糖化血红蛋白（HbAlc）、总胆固醇（TC）、血尿酸（BUA）、甘油三酯（TG）、 高密度脂蛋白（HDL）、 低密度脂蛋白（LDL）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、尿素氮（BUN）和血肌酐（SCR）。

1.3.3 粪便宏基因组DNA 提取及测序 使用宏基因组DNA 提取试剂盒提取粪便样品宏基因组，利用1.0%琼脂糖凝胶电泳和微量紫外分光光度计检测DNA 样品的完整度、纯度和浓度，将符合要求的DNA 置于-20 ℃冰箱备用。使用Illumina Hiseq Xten 测序平台检测所有粪便样本宏基因组DNA 序列。

1.3.4 生物信息学分析 应用HUMAnN2 工具对高质量的序列进行微生物群落结构分析[10]。同时基于物种信息使用香农指数（Shannon index）和辛普森指数（Simpson index）对每份样本的α 多样性指数进行评估，通过Parallel-META 软件 （Version 3.4.4）分析肠道菌群功能和代谢通路信息[11]。使用megahit 软件基于宏基因组数据组装单个细菌基因组，通过binning 方法在菌株水平分析益生菌对肠道菌群的影响[12]。利用metabat2 软件取出高质量基因组（完整度＞80%，污染率＜5%）。使用drep 软件[12]，基于默认参数去除冗余基因组，将每个样品的clean reads 比对到非冗余基因组集合，计算每百万条序列中来自某基因每千碱基长度的序列数，即bin 在样品下的丰度=（该样品比对到该bin 序列数×106）/[该样品样品比对到非冗余bin集合序列数×bin 长度（bp）]。

1.3.5 统计学分析 使用配对Mann-Whitney 检验对两组样品治疗前、 后菌群结构进行差异显著性分析，使用Benjaminiand Hochberg 的方法校正多次检验的假阳性率[13]，将P＜0.05 视为差异显著。使用R 语言软件（v3.3.2）中的Prcomp 函数进行主成分分析（Principal component analysis，PCA）。将不同组Z 值＞1.6 的代谢通路判定为在两组间存在显著差异[14]。使用R 软件和Origin 8.5 软件作图。

2 结果与分析

2.1 试验期间血液指标分析

分析了治疗前和治疗90 d 后血液样品中11种常见的基础指标，结果见表2。

表2 血液指标信息Table2 The information of blood indicators

运用Wilcoxon 检验对治疗前、后指标进行差异性检验。基于血液指标的数据显示，经过90 d的治疗，两组患者空腹血糖、糖化血红蛋白、总胆固醇、甘油三脂、低密度脂蛋白和血尿酸均有较大幅度下降，高密度脂蛋白无明显变化。谷丙转氨酶、谷草转氨酶和血尿氮有上升趋势。同时也发现在益生菌组空腹血糖、 糖化血红蛋白和血尿酸出现显著下降（P＜0.05），而安慰剂组无显著差异。其它各项血液指标如甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、血尿氮和血肌酐在治疗前、后均无显著差异。

2.2 T2D 患者肠道菌群多样性分析

通过Illumina Hiseq Xten 宏基因组测序，20份粪便样品共得到182.13Gb 高质量序列，平均每个样品（7.29±0.97）Gb 序列。基于治疗前样品的HUMAnN2 分析结果，发现T2D 患者肠道菌群在门水平主要由厚壁菌门 （Firmicutes）、 拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）和疣微菌门（Verrucomicrobia）组成，各菌门的相对含量分别为45.85%，33.11%，16.48%，2.87%和1.55%。各样品治疗前、后，肠道菌群在属和种水平的相对含量如图1所示，在属水平上所有样品共检测到89 个菌属，其中19 个菌属的相对含量大于1%（图1a）。这19 个菌属共占肠道细菌菌群的92.26%，其中真杆菌属（Eubacterium）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、粪杆菌属（Faecalibacterium）、普氏菌属（Prevotella）和瘤胃球菌属（Ruminococcus）的平均相对含量最高，分别为12.35%，12.24%，6.12%，6.00%和5.72%。在种水平上共检测到240 个菌种，其中平均相对含量大于1%的共有26 个 （图1b），粪便拟杆菌（Bacteroides stercoris，9.89%）、 直肠真杆菌（Eubacterium rectale，7.70%）、普拉氏粪杆菌（Faecalibacterium prausnitzii，6.12%）、青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis，5.78%） 和长双歧杆菌（Bifidobacterium longum，5.08%） 等相对含量较高。

图1 志愿者肠道菌群组成Fig.1 The gut bacterial composition of volunteers

2.3 T2D 患者经治疗后肠道菌群结构的变化分析

通过分析香农指数和辛普森指数评估菌群α多样性。由图2可知，虽然治疗前、后α 多样性指数没有发生显著变化，但是治疗后患者肠道菌群α 多样性均呈下降趋势。

图2 样品α 多样性指数比较分析Fig.2 Comparison of the α-diversity index between samples

为了进一步评估两种治疗方案对肠道菌群结构的影响，采用主成分分析评估患者在治疗前、后肠道菌群结构的差异，结果如图3所示。同一患者在治疗前、后存在明显的聚类趋势，同时益生菌组治疗前、后菌群结构更相似，安慰剂组则表现的更加离散。

配对Mann-Whitney 检验结果显示，益生菌组治疗后，门水平上放线菌门显著增加（P＜0.05），在属的水平，双歧杆菌属和瘤胃球菌属显著增加（P＜0.05），另支菌属显著降低（P＜0.05）；在种的水平上霍氏真杆菌、长链多尔氏菌（Dorea formicigenerans）和卵瘤胃球菌（Ruminococcus obeum）显著增加（P＜0.05），单形拟杆菌（Bacteroides uniformis）、毛螺科菌（Lachnospiraceae bacterium）、多行拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron）和nordii 拟杆菌（Bacteroides nordii）显著降低（P＜0.05）。值得关注的是动物双歧杆菌在益生菌组治疗90 d 后有明显的增加，接近显著水平（P=0.06），而安慰剂组未发现显著变化的细菌。

2.4 基于宏基因组数据的菌株水平基因组组装

图3 志愿者菌群结构主成分分析图Fig.3 The PCA of gut microbiota population structure

基于各样品测序数据，本研究共组装得到1 192 个菌株基因组。通过进一步评估各菌株基因组的完整度和污染率，剔除完整度低于80%或污染率大于5%的基因组，最后保留了230 个菌株基因组进行后续分析。通过对各基因组进行注释，结果显示：上述基因组可以注释到103 个不同的菌株，组装结果中数量较多的菌株包括普拉粪杆菌（Faecalibacterium prausnitzii）13 个、未培养瘤胃球菌属 （uncultured Ruminococcus sp.）11 个和瘤胃杆菌属（Ruminococcaceae bacterium）10 个。抽取各样品的测序序列以相同序列数后，将测序原始数据与各基因组进行比对，以确定各菌株在各样品中的相对含量。通过配对Mann-Whitney 检验比较治疗前、后各菌株在样品中的变化，共发现14个菌株在益生菌组治疗前、后发生了显著变化，结果如表3所示。益生菌组治疗后，有较多的属于拟杆菌属和梭菌属的菌株相对含量显著下降，而部分属于双歧杆菌和真杆菌属的菌株显著升高。

2.5 肠道菌群与血液指标的相关性分析

由上述分析发现患者菌群发生一定改变，同时患者病情得到改善。本文运用Spearman’s rank相关性分析解析菌群与各血液指标的相关性，结果如图4所示。结果发现，双歧杆菌、丹毒丝菌属（Erysipelotrichaceae）、 长双歧杆菌和布氏瘤胃球菌与空腹血糖浓度负相关，罗斯氏菌属和毛螺旋菌属与空腹血糖正相关；双歧杆菌属、丹毒丝菌属和长双歧杆菌与糖化血红蛋白浓度负相关，罗斯氏菌属、普通拟杆菌、马塞拟杆菌、多行拟杆菌、nordii 拟杆菌和longicatena 多尔氏菌与糖化血红蛋白浓度正相关；多尔氏菌、假小链双歧杆菌、长链多尔氏菌和霍氏真杆菌与血尿酸浓度负相关，毛螺科菌属和粪便拟杆菌与血尿酸浓度正相关。

表3 益生菌治疗前、后发生显著变化的菌株Table3 The strains have changed after supplement probiotic

图4 肠道优势菌群与血液指标关联分析热图Fig.4 The spearman correlation between gut microbiota and blood indicators

2.6 肠道菌群功能代谢分析

通过Parallel-META 软件将基因序列与KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）数据库进行注释，得到6 549 个KOs（Kyoto encyclopedia）。为了解析治疗前、后肠道菌群功能的改变，本研究将所检测到的基因进一步划分到KEGG 代谢通路水平，分析治疗前、后两组代谢通路差异，结果如表4所示。

表4 治疗前、后肠道菌群差异代谢通路Table4 Differential metabolic pathway of gut microbiota before and after treatment

益生菌组注释得到4 个差异代谢通路，均在治疗后丰富度下降，包括酮体的合成与降解，鞭毛组装，脂多糖合成和细菌趋药性。安慰剂组注释得到4 个差异代谢通路，同样在治疗后丰富度下降，包括脂多糖合成，鞭毛组装，细菌分泌系统和香叶醇降解。

治疗后两组患者肠道菌群之间差异代谢通路如表5所示。结果显示：安慰剂组含量较高的代谢通路有3 个，包括香叶醇降解，磷酸转移酶系统和鞭毛组装。益生菌组含量较高的代谢通路包括双酚降解和D-谷丙酰胺代谢通路。

表5 治疗后益生菌组和对照组之间的差异代谢通路Table5 Differential metabolic pathways between probiotic group and control group after treatment

3 讨论

T2D 是一种因胰岛素作用不足而引起以高血糖为特征的代谢性疾病，除了常规的血糖值外，糖化血红蛋白也是一种重要的诊断指标[15]。本研究发现，患者经治疗后各项空腹血糖、总胆固醇、糖化血红蛋白和甘油三脂均有所改善，由此证明两种治疗方案可有效缓解T2D 患者症状。其中益生菌组空腹血糖和糖化血红蛋白出现显著下降，这一结果与之前的研究结果相一致[16]。谷丙转氨酶、谷草转氨酶和血尿氮出现上升趋势，可能是因机体药物的摄入对肝脏、肾脏损伤所致。值得关注的是益生菌组血尿酸浓度显著降低，血尿酸与肾脏疾病相关，血尿酸增加可加重糖尿病肾病的发生[17]。与安慰剂组相比，补充益生菌Probio-Fit®可有效辅助二甲双胍达到降血糖的作用，同时具有降低糖尿病、肾病的可能性。

有研究发现二甲双胍的作用位置以肠道为主，而静脉注射二甲双胍无法调节人类血糖[18-19]。这可能由于二甲双胍的降血糖作用与调节肠道菌群中的部分物种有关，这些菌群协助二甲双胍发挥降糖作用[20]。也有研究认为药物能够改变肠道微生物菌群结构和代谢，从而影响宿主代谢功能[21]。通过对患者肠道菌群结构的分析发现：本研究患者的肠道菌群结构与Nadja 等[4]的研究结果相似。值得注意的是患者经过二甲双胍治疗后，肠道菌群α 多样性均出现下降趋势，该结果与二甲双胍显著降低高脂饮食肥胖Wistar 大鼠肠道菌群多样性和丰度相一致[22]。该变化趋势据报道[23]可增加葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性。

患者在接受二甲双胍治疗的同时补充益生菌Probio-Fit®，结果发现大量有益菌如双歧杆菌属和霍氏真杆菌相对含量显著增加；而有害菌降低，如另支菌属和毛螺科菌相对含量显著下降。同时还有部分拟杆菌种出现显著下降。有研究[24]发现肠道中的拟杆菌与另支菌属在肠道中相对含量常出现同时升高或降低的现象。霍氏真杆菌是一种可以代谢葡萄糖和发酵中间产物产生丁酸盐的细菌[25]。近期研究认为，丁酸盐是一种短链脂肪酸，短链脂肪酸占健康人能量来源的5%～10%，对哺乳动物的能量代谢有多重有益影响[26-27]，而患有T2D 的人群肠道中丁酸盐产生菌减少[28]，因此该菌的增加对T2D 患者有益。毛螺科菌与代谢紊乱相关，它可诱导空腹血糖显著升高[29]，该结果与本研究结果一致。同样霍氏真杆菌与代谢紊乱正相关。本研究显示益生菌组该菌出现显著降低。赵立平等[30]也发现补充复合益生菌可降低代谢紊乱小鼠肠道中霍氏真杆菌的相对含量。本研究发现，治疗90 d 时，益生菌组发现较多的动物双歧杆菌，这可能与摄入的益生菌Probio-Fit®中含有动物双歧杆菌V9 有关。众多研究显示，双歧杆菌可作为益生菌添加在食品中，是临床干预的潜在理想对象。有研究称糖尿病人群肠道中双歧杆菌的数量显著少于健康人群[31]。本研究通过相关性分析显示：双歧杆菌与空腹血糖和糖化血红蛋白呈负相关。Gu 等[32]也得到相似的研究结果。通过口服摄入双歧杆菌可能是一种有效降低T2D 患者血糖的途径。PCA 分析显示：益生菌组治疗前、后菌群结构更为相似，这可能是由于二甲双胍摄入导致肠道菌群在短时间内发生剧烈的变化，而益生菌可在一定程度上维持肠道菌群稳态，缓解因药物摄入而导致的肠道菌群失调。本研究采用单菌株基因组组装的方法成功组装出的一些菌株在益生菌组治疗过程中发生了显著变化，其中属于两歧双歧杆菌菌株、 瘤胃球菌属菌株和属于真杆菌的菌株显著增加，而较多属于拟杆菌属菌株出现显著下降，整体菌株水平的变化趋势与HUMAnN2 工具统计得到的结果一致。而这些菌株的代谢功能有待后续的基因组学分析，以进一步揭示其变化与T2D 症状之间的关系。

在功能水平，有研究发现肠道微生物产生的脂多糖具有诱发肥胖，胰岛素抗性和糖尿病[21，33]的作用，而具有鞭毛组装通路的相关细菌则可以间接参与肥胖等人类代谢性疾病[34]。本研究中，两组患者治疗后肠道菌群执行脂多糖合成和鞭毛组装代谢的基因丰富度均显著下降，表明患者肠道菌群代谢向有利于宿主健康的方向转变。此外，安慰剂组在治疗后鞭毛组装通路丰度较益生菌组高，表明益生菌结合二甲双胍比单独服用二甲双胍效果好。香叶醇代谢通路主要包含于假单胞菌属、无色杆菌属和农杆菌属中[35]，而这些菌属大多为致病菌和条件致病菌[36]。本研究结果表明香叶醇降解途径在治疗后丰富度降低，同时治疗后安慰剂组比益生菌组丰富度高，这可能与上述有害菌的降低有关。由此也表明益生菌对部分有害菌具有抑制作用。

4 结论

综上所述，对T2D 患者补充益生菌Probio-Fit®有助于二甲双胍的降血糖作用，同时能改善肠道菌群的结构和代谢通路，使患者肠道中一些致病菌降低，有益菌升高，部分参与代谢性相关疾病的代谢通路基因丰富度下降。然而，样本量较少是本研究的局限性。本研究团队已开始进行大量样本的采集，以更深入地分析复合益生菌联合二甲双胍对T2D 患者治疗的影响，以期为治疗T2D 患者提供更有效的方法。