基于纯培养方法和PacBio三代测序技术研究蒙古国传统酸马奶中乳酸菌多样性

刘文俊 多拉娜 刘亚华 任冬艳 张和平 孟和毕力格

（内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室 农业农村部奶制品加工重点实验室内蒙古自治区乳品生物技术与工程重点实验室 呼和浩特010018）

酸马奶是以新鲜马奶为原料，经乳酸菌和酵母菌等微生物共同自然发酵形成的酸性、 低酒精含量的乳饮料[1]。酸马奶中含有丰富的蛋白质、脂肪、糖类、维生素、氨基酸等营养成分。有研究表明：在所有可食用畜乳中，马乳的组成最接近人乳[2]。除营养丰富外，酸马奶还具有驱病保健的功效，蒙医学的相关研究表明酸马奶具有降血压，降血脂，防止肺结核，治疗便秘、黄褐斑等疗效[2-4]。目前在蒙古国和内蒙古等地区均设立了“酸马奶疗养中心”，利用酸马奶治疗心血管系统病、消化系统病、 神经系统疾病和结核等慢性消耗性疾病均有一定疗效[5]。酸马奶中的乳酸菌赋予酸马奶独特风味特征，同时其代谢产物与酸马奶的医疗作用密不可分。全面深入了解传统酸马奶中的细菌多样性和菌群组成，分离筛选具有优良特性的乳酸菌菌株，对酸马奶品质改良，工业化应用以及益生菌的开发利用具有重要意义。

传统的纯培养方法是常用来研究生态环境中的微生物组成的经典方法，其培养条件具有局限性，有研究表明自然界中只有不到1%的微生物可以培养[6]，这表明纯培养方法不能完全揭示样品中的微生物组成。宏基因组测序技术的出现为准确、全面地了解菌相复杂的环境样品中微生物群落结构提供了有效手段。以PacBio SMRT 为代表的三代测序技术具有长读长，高通量的优点，通过其特有的CCS 测序模式，将同一条序列多次重复测序后的结果相互校正，可以获得测序质量非常高的一致性序列。借助该技术研究人员可以在“种”水平对样品中的微生物进行分析[7]。

本研究以采集自蒙古国的12 份酸马奶为对象，通过纯培养方法分离样品中的乳酸菌，并应用16S rRNA 测序技术对其进行鉴定。同时采用PacBio SMRT 测序技术分析样品中的乳酸菌多样性，以期为传统酸马奶的品质改良和工业化生产提供理论依据，为具有良好益生特性的乳酸菌的筛选和研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 本研究用的12 份传统酸马奶样品采自蒙古国的7 个省区，具体采样信息见表1。

表1 蒙古国传统酸马奶样品的采集信息表Table1 Information of traditional koumiss samples in Mongolia

1.1.2 试剂与仪器 MRS 培养基 （CM0785B）和M17 培养基（CM0817B），英格兰OXOID 公司；蛋白酶K，北京全式金生物技术有限公司；PCR 试剂，大连TaKaRa 公司；OMEGA DNA isolation kit试 剂 盒，美 国OMEGA 公 司；KAPA HiFiHot-StartReadyMix PCR 试剂盒，美国KAPA 公司；5×TBE 电泳缓冲液 （Tris 碱54 g、Na2EDTA·2H2O 3.72 g、硼酸27.5 g，定容1 000 mL，pH 8.0）、1.0%的琼脂糖胶 （1.0 g 琼脂糖溶于100 mL 0.5×TBE缓冲液），天津基准化学试剂公司。

CDS8000 型UPV 凝胶成像分析系统，北京赛智创业科技有限公司；DYY-12 电泳仪，北京六一仪器厂；ND-1000 型微量紫外分光光度计，美国Nano Drop 公司；AB/Life 梯度PCR 仪，美国AB公司；Eppendorf 5810R 台式高速冷冻离心机，德国Eppendorf 公司；Pacifico SMRT RS II 测序平台，美国PB 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集 将传统酸马奶在其发酵容器中充分搅拌后，用移液枪吸取2 mL 于装有无菌15 mL 离心管（内含0.5 g 灭菌缓冲剂，m淀粉∶m碳酸钙=50∶1）中，另取30 mL 酸马奶装入无菌离心管中，加入10 mL RNA/DNA 样品保护剂 （TaKaRa），混匀、标号。将样品低温运输，并快速带回实验室-20 ℃保存。

1.2.2 乳酸菌的分离与鉴定 乳酸菌的分离采用涂布法，将样品摇匀，用无菌枪头吸取0.5 mL 样品置于4.5 mL 生理盐水中，充分混匀，以10 倍梯度稀释法[8]对样品进行稀释，分别吸取1 mL 稀释度为10-5，10-6，10-7的稀释液涂布于含有0.1%抑菌素 （含V放线菌酮∶V多粘菌素=1∶1） 的无菌MRS 和M17 琼脂培养基上，30 ℃厌氧培养48～72 h。待菌落形成后，随机挑选形态特征不同的单个菌落，并记录其菌落形态，如颜色、形状、大小等。将菌落于MRS 或M17 培养基上划线纯化。选取革兰氏染色阳性，过氧化氢阴性的纯培养物作为疑似乳酸菌。将纯化后的纯培养物加入质量分数为0.1%谷氨酸钠的脱脂乳保护剂，分装于无菌安瓿管和冻存管中，于-80 ℃保存、备用[9]。

菌株基因组DNA 的提取：采用CTAB-液氮冻融法提取样品DNA[10]。乳酸菌DNA 的OD260/280值在1.8～2.0 之间即为纯DNA 样品。将提取的基因组DNA 稀释至100 ng/μL 作为PCR 扩增模板。PCR 扩增16S rRNA 基因所用引物为通用引物，正向引物为FA-27F （5′-GCAGAGTTCTCGGAGT CACGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′），反 向引 物 为RA -1495 R （5′-AGCGGATCACTTCA CACAGGACTACGGCTACCTTGTTACGA -3′ ）[11]。PCR 反应体系（50 μL）：DNA 模板（质量浓度100 ng/μL）2 μL，10×Easy Taq Buffer（Mg2+）5 μL，高纯度dNTPs（浓度2.5 mmol/L）4 μL，正、反向引物各（浓度10 mmol/L）1.5 μL，DNA 聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，去离子水补充至50 μL[12]。16S rRNA 基因的PCR 扩增条件：94 ℃5 min；94 ℃1 min，58 ℃1 min，72 ℃2 min，30 个循环；72 ℃10 min[13]。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后，可观察到在大约1 500 bp 的位置有一条清晰、明亮的条带。该条带无拖尾、弥散现象，未发现明显非特异性扩增现象，说明分析菌株的16S rRNA 基因扩增产物可以满足测序的要求。将产物扩增成功的PCR 产物送至上海美吉生物医药科技有限公司测序。

1.2.3 16S rRNA 基因序列测定和构建系统发育树 将测序得到的序列应用DNA Star 软件中SeqMan 模块进行整理拼接。利用NCBI 中的BLAST （https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）将分离株的16S rRNA 基因序列与GenBank 数据库进行同源性比对，寻找同源性最高的已知分类学地位的菌种[14]。同时，将拼接好的菌株序列上传至GenBank 数据库（基因登录号：MK369822-MK369883）。将待鉴定菌株序列与同源性最高的模式菌株序列应用Mega 6.0 软件进行ClustalW比对，运用邻接法（Neighour-joining，N-J）构建基于16S rRNA 的系统发育树，比较它们之间的亲缘关系[15-16]。

1.2.4 样品中微生物宏基因组DNA 的提取 采用OMEGA DNA isolation kit 试剂盒抽提酸马奶样品中微生物宏基因组DNA，用1.0%琼脂糖凝胶电泳和微量紫外分光光度计检验DNA 样品的完整度、纯度以及浓度。上述3 个条件都满足后续试验要求的DNA 样品暂时存放于-20 ℃冰箱备用。

1.2.5 文库构建与上机测序 使用KAPA HiFi HotStart Ready Mix 高保真PCR 试剂盒将满足要求的DNA 作为模板进行PCR 扩增。16S rRNA基因序列的正向引物为27F（5′-AGAGTTTGATCMTG GCTCAG-3′），其反向引物为1492R （5′-AC CTTGTTACGACTT-3′）。为了区分同一个文库中的不同样品，用带有识别标签（Barcode）的引物对每个样品进行PCR（聚合酶链式反应）扩增。PCR 扩增体系（50 μL）：正向引物（10 μmol/L）1.5 μL，反向引物（10 μmol/L）1.5 μL，模板DNA（＜100 ng）1.5 μL，KAPA Mix 25.0 μL，ddH2O 补足至50 μL。扩增条件：95 ℃预变性3 min，98 ℃变性20 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，30 个循环，72 ℃末端延伸2 min。各样品的PCR 产物经纯化后等质量混合，用试剂盒构建文库，根据厂商提供的说明书严格执行。对构建好的文库加测序引物和聚合酶后，使用PacBio RS II 仪器上机测序。

1.2.6 高质量序列的提取 使用RS_ReadsOfinsert.1 对1.2.5 节中生成的原始序列进行质量控制，保留符合以下标准的序列：①最小通过率设定为5；②最小预测精确度为90；③最小插入序列长度为1 400 bp；④最大序列长度为1 800 bp。

1.2.7 生物信息学分析 根据标记的Barcode 将原始序列划分到每个样品中，然后去掉Barcode和引物序列，使用QIIME 平台（v1.70）对高质量的序列进行生物信息学分析。首先采用PyNAST 将序列校准排齐后，在97%的相似性条件下划分操作分类单元 （Operational taxonomic units，OTU）。去除属于嵌合体OTU 后，使用RDP（Ribosomal Database Project，Release11.5）和Greengenes（v13.8）数据库确定各OTU 的分类学地位，进而计算各样品在门、纲、目、科、属和种水平的相对含量。计算各组样本香农指数（Shannon-Wiener index）、辛普森指数（Simpson index）、超1 指数（Chao1 index）和发现的物种数量指数 （Observed species），用于评估各样本α 多样性。

1.2.8 数据统计 采用Origin 8.6 软件、Graphpad 6.0 和R 语言软件（v3.3.2）作图。

1.2.9 核酸序列登记号 本研究中涉及的序列数据已提交MG-RAST 数据库，序列号为mgp89049。

2 结果与分析

2.1 酸马奶中乳酸菌的纯培养法分离鉴定

2.1.1 系统发育树的构建和乳酸菌鉴定 从12份蒙古国传统酸马奶中分离出62 株革兰氏阳性、过氧化氢阴性的疑似乳酸菌菌株。

通过16S rRNA 基因序列同源性比对，62 株分离株鉴定为乳酸菌的3 个属，6 个种。将待鉴定菌株序列与同源性最高的模式菌株序列应用Mega 6.0 软件构建基于16S rRNA 的系统发育树。蒙古国传统酸马奶中分离菌株的16S rRNA基因序列的系统发育树如图1所示。可以看出菌株IMAU20941 和IMAU20954 与粪肠球菌（Enterococcus faecalis）ATCC 19433T聚为一类，且相似性为100%，将其鉴定为粪肠球菌。菌株IMAU20925，IMAU20960，IMAU20965，IMAU20966和IMAU20967 与模式菌株屎肠球菌（Enterococcus faecium）ATCC 19434T聚为一类，且相似性为100%，将其鉴定为屎肠球菌。菌株IMAU20946，IMAU20929，IMAU20950，IMAU20926，IMAU20930，IMAU20951 和IMAU20956 与产马乳酒乳杆菌（Lactobacillus kefiranofaciens）ATCC 43761T聚 为一类，且相似性大于99%，将其归为马乳酒样乳杆菌。菌株IMAU20910，IMAU20915 和IMAU20921与嗜热链球菌 （Streptococcus thermophilus）ATCC 19258T聚为一类，且相似性为100%，将其鉴定为嗜 热 链 球 菌。菌 株IMAU20904，IMAU20905，IMAU20906，IMAU20907 等20 株菌株与植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）ATCC 14917T 聚为一类，且相似性大于99%，将这20 株菌株归为植物乳 杆 菌 。菌 株 IMAU20901，IMAU20903，IMAU20914，IMAU20916 等25 株菌与标准菌株瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus） ATCC 15009T聚为一类，且相似性为100%，将这25 株菌鉴定为瑞士乳杆菌。

图1 蒙古国分离株的16S rRNA 基因序列的系统发育树Fig.1 Phylogenetic analysis of 16S rRNA gene sequences of the isolates in Mongolia

由16S rRNA 基因序列构建的系统发育树可知，分离自蒙古国不同地区的酸马奶中的62 株乳酸菌鉴定为乳酸菌的6 个种，包括瑞士乳杆菌（25株）、植物乳杆菌（20 株）、嗜热链球菌（3 株）、屎肠球菌（5 株）、产马乳酒乳杆菌（7 株）和粪肠球菌（2株）。

2.1.2 蒙古国传统酸马奶中优势菌群分析 从12 份酸马奶中共分离出62 株乳酸菌，分别为3个属、6 个种，分离株信息见表2。12 份样品中有9份样品分离出瑞士乳杆菌，共得到25 株，占总分离株的40.32%，说明瑞士乳杆菌为蒙古国不同地区传统乳制品中乳酸菌的优势菌种。从样品MG3和MG7 分离的菌株类别最多，其中从MG7 分离到的菌株最多，共分离出12 株乳酸菌，分别为瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌和马乳酒样乳杆菌。综上所述，本研究中，传统酸马奶样品的优势菌株为瑞士乳杆菌。

2.2 酸马奶中乳酸菌宏基因组学多样性分析

2.2.1 测序深度评估 12 份样品中由于DNA 提取质量和测序建库中出现问题，只有8 份样品可以满足测序要求并获得高质量数据，因此本研究对满足测序要求的8 份酸马奶样品的宏基因组进行分析。8 份酸马奶样品共产生44 758 条高质量完整的16S rRNA 基因序列，每个样品平均为8 846（范围2 417～11 432）条。根据97%相似度划分OTU 后，共得到848 个具有代表性的OTU。8份样品中在MG12 样品中发现物种数最多，在MG3 样品中发现物种数最少，具体信息见表3。

表2 蒙古国传统酸马奶样品中菌株分离鉴定结果Table2 The distribution of lactic acid bacteria from traditional Koumiss in Mongolia

表3 样品序列丰度及细菌多样性信息Table3 Sequence abundance and microbial diversity of samples

根据表3信息绘制稀疏曲线和香农曲线，用于分析和评价各样品测序量是否符合后续生物学分析（图2）。图2a 稀疏曲线所示，OTU 的数量未达到平衡状态，这表明随着测序量的增加，新的细菌种系将被发现。而图2b 显示的香农曲线已达到水平状态，这表明随着测序量的增加，细菌多样性不再改变，说明当前测序量可以满足后续分析的需要。

图2 稀疏曲线图（a）和香农多样性图（b）Fig.2 Rarefaction curves（a）and shannon diversity index curves（b）

2.2.2 酸马奶中乳酸菌多样性分析 在8 份酸马奶样品中共检测到4 个细菌门，包括厚壁菌门（98.68%）、变形菌门（1.29%）、放线菌门（0.02%）和拟杆菌门（0.01%），其中厚壁菌门为8 份酸马奶样品的优势菌门，拟杆菌门为MG7 样品特有菌门（0.04%），放线菌门仅存在于MG7、MG10 和MG11样品中，相对含量分别为0.03%，0.04%和0.10%。

在属水平上，从8 份酸马奶样品中共检测到24 个细菌属，其中属于乳酸菌的共5 个属，包括乳杆菌属（95.56%）、乳球菌属（1.98%）、链球菌属（0.86%）、明串珠菌属（0.13%）和肠球菌属（0.03%）。其它一些非乳酸菌属主要包括假单胞菌属（0.96%）、醋酸杆菌属（0.12%）和巨型球菌属（0.11%）等。8 份样品中菌属的相对含量存在差异，MG3 样品乳杆菌属最高（99.62%），MG12 样品的乳杆菌属相对含量最低（86.83%），其它样品中乳杆菌属相对含量均高于95%。MG12 样品的乳球菌属相对含量最高（11.05%），而MG3 样品中乳球菌属相对含量最低（0.04%）。MG7 样品中的链球菌属相对含量最高 （3.70%），MG3 样品中未检出链球菌属。MG11 样品中明串珠菌属最高（0.48%），在MG6、MG8 和MG13 中未检出明串珠菌属。MG12 样品中肠球菌属最高 （0.12%），MG3、MG8、MG11 和MG13 未检出肠球菌属。

图3 酸马奶中优势乳酸菌及其相对含量基于属水平Fig.3 Relative abundance of lactic acid bacteria in the samplesat the genus level

在种水平上，从8 份酸马奶样品中共鉴定出42 个细菌种，属于乳酸菌的有17 个。采用测序技术捕捉到大部分传统纯培养方法分离的菌株，具体信息详见表2。8 份样品平均相对含量大于0.1%的乳酸菌种有7 个（图4），包括：瑞士乳杆菌（94.64%）、乳酸乳球菌（1.70%）、副乳房链球菌（0.84%）、棉籽糖乳球菌（0.27%）、肠膜明串珠球菌（0.13%）、开菲尔乳杆菌（0.12%）和产马乳酒乳杆菌（0.10%），其中瑞士乳杆菌为8 份酸马奶样品的绝对优势菌种，其它非乳酸菌菌种主要包括铜绿假单胞菌（0.95%）和溶酪巨球菌（Macrococcuscaseolyticus，0.11%）等。8 份样品中不同菌种的相对含量存在差异。MG3 样品的瑞士乳杆菌相对含量最高 （99.28%），MG12 样品的瑞士乳杆菌相对含量最低（84.1%），其余样品瑞士乳杆菌相对含量均高于90%。MG12 样品中的乳酸乳球菌相对含量较高（9.31%），MG3 样品相对含量最低（0.03%）。MG7 样品的副乳房链球菌最高（3.48%），而MG3样品中未检出副乳房链球菌。MG12 样品中棉籽糖乳球菌最高（1.69%），MG3 和MG11 样品中均未检出棉籽糖乳球菌。MG13 样品中的开菲尔乳杆菌最高（0.46%），MG6 样品中的开菲尔乳杆菌相对含量最低（0.001%）。MG8 样品中马乳酒样乳杆菌最高（0.22%），MG3 样品中未检出马乳酒样乳杆菌。

图4 酸马奶中优势乳酸菌及其相对含量基于种水平Fig.4 Relative abundance of lactic acid bacteria in the koumiss samplesat species level

2.2.3 OTU 水平乳酸菌组成分析 8 份酸马奶样品共产生278 个OTU（图5a），其中仅出现在一份样品中的OTU 共有128 个，占OTU 总数的46%，然而其所包含的序列数仅为179 条，占所有质控后合格序列数的0.40%。而8 份样品中共有的OTU 为35 个（图5b），所包含的序列数为42 446条，共有的OTU 分别占OTU 总数和质控后合格序列数的12.6%和95.99%。通过RDP 和Greengene 数据库比对发现，31 个OTU 被鉴定为瑞士乳杆菌，2 个OTU 被鉴定为乳酸乳球菌，1 个OTU被鉴定为铜绿假单胞菌，1 个OTU 被鉴定为开菲尔乳杆菌，它们所包含的序列分别占质控合格序列数的93.04%，0.93%，0.78%和0.08%。由此可见，本研究的8 份酸马奶样品共有大量的核心细菌菌群，同时，8 份样品均存在一些特有OTU，MG3 样品特有OTU 最少 （3 个），MG7 和MG6 特有OTU 最多（33 个）。MG3 特有乳酸菌为希氏乳杆菌（Lactobacillus hilgardii），MG6 特有乳酸菌为芜菁乳杆菌（Lactobacillus rapi），MG7 特有乳酸菌为乳明串珠菌（Leuconostoc lactis）。此外，不同样品还包括一些特有的非乳酸菌菌种，例如MG7 特有菌种加纳醋酸杆菌 （Acetobacter ghanensis）、piscium 金黄杆菌（Chryseobacteriumpiscium）、解脲金黄杆菌（Chryseobacteriumureilyticum）、解没食子酸链球菌（Streptococcus gallolyticus）和窄食单胞菌（Stenotrophomonas chelatiphaga）。MG8 特有菌种（Stenotrophomonas rhizophila），MG10 特有菌种戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）和地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），MG11 特有菌种黄色微球菌（Micrococcusflavus），MG12 特有菌种tilapiae莱茵海默氏菌（Rheinheimeratilapiae），MG13 特有菌种约氏不动杆菌（Acinetobacterjohnsonii）。

图5 酸马奶样品中OTU 出现次数的统计和不同样品特有（a）和共有OTU 分析（b）Fig.5 Frequency of occurrences of OTU for common （a） and specific （b） in the koumiss sample

3 讨论和结论

本文采用纯培养方法从采集自蒙古国的12份酸马奶中共分离出62 株乳酸菌，通过16S rRNA 序列比对分析和系统发育分析对其进行种属鉴定，共鉴定出3 个细菌属，6 个细菌种，其中优势细菌为瑞士乳杆菌，占总分离株的40.32%。孟和毕力格等[17]通过纯培养方法研究发现蒙古国乌兰巴托市酸马奶中的优势菌种为嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）。Ishii 等[18]用纯培养方法研究发现蒙古国Haruha 和Buriat 地区酸马奶中优势菌为植物乳杆菌。这些研究与本研究结果不同。孙天松等[19]研究发现新疆地区酸马奶优势菌为瑞士乳杆菌。刘芳等[20]研究发现内蒙古地区酸马奶优势菌为乳酸乳杆菌 （Lactobacillus lactis）。这些研究表明不同国家、同一国家不同地区酸马奶中乳酸菌的组成存在较大差异。

利用PacBio SMRT 测序技术除了检测到大部分纯培养方法分离的菌株外，还检测到本研究中通过纯培养方法未分离的其它菌种，其中也包括一些具有安全风险的细菌，这些菌株通过纯培养方法未分离到，这可能是由于成熟的酸马奶pH值很低（2.8～3.5），大部分致病菌难以存活。还有少数通过纯培养分离到的菌株未被测序方法检测到，可能是由于这些细菌含量较低，目前的测序深度不足以对其进行检测，测序深度的增加可能检测到这些细菌[21]。从8 份样品中共检出5 个乳酸菌菌属，20 个乳酸菌菌种，其中优势菌种为瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus），这也证实之前通过纯培养方法得到的部分研究结论。Oki 等[22]采用454 焦磷酸测序分析采集自蒙古国不同地区的酸马奶，结果发现瑞士乳杆菌为优势菌种。其木格苏都等[23]运用PacBio SMRT 测序技术对锡林郭勒盟地区马奶动态发酵过程中的细菌多样性进行研究，结果发现瑞士乳杆菌同样为该地区酸马奶中的优势菌种。本研究利用PacBio SMRT 测序技术发现蒙古国不同地区酸马奶的核心菌群几乎均为瑞士乳杆菌，瑞士乳杆菌在温度和pH 值的耐受特性方面具有一定的优势，其较强的蛋白水解活性、产乳酸性能等功能特性与最终发酵产品的品质息息相关[24-25]。此外，通过PacBio SMRT 测序技术作者还发现了许多纯培养方法未检测到的乳酸菌，如乳酸乳球菌、棉籽糖乳球菌、肠膜明串珠球菌、开菲尔乳杆菌和副乳房链球菌等。研究发现，棉籽糖乳球菌可以弥补牛奶中乳酸乳球菌生长缓慢的不足，而乳酸乳球菌可以弥补棉籽糖乳球菌较差的酪蛋白水解活性，它们之间的互补性可能有助于开发具有新特性的乳制品[26]。副乳房链球菌为条件致病菌[27]，通过纯培养方法未分离到，这可能是由于传统酸马奶的制作多采用开放环境的自然发酵工艺导致其存在，然而随着pH 的降低已经失去活性。本研究还发现8 份酸马奶虽然拥有大量的核心菌群，但一些样品中特有的乳酸菌，例如MG3 特有菌种希氏乳杆菌，MG6 特有菌种芜菁乳杆菌，MG7 特有菌种乳明串珠菌和MG10 特有菌种戊糖乳杆菌，这些乳酸菌可为后续通过纯培养方法分离这些菌株提供一定理论依据。此外，本研究发现不同样品还存在一些特有的非乳酸菌菌种，例如MG12 特有菌种tilapiae 莱茵海默氏菌，其常见于水体环境中[28]，部分样品特有菌株为原料乳中常见的嗜冷菌，例如MG8 特有菌种嗜根寡养单胞菌 （Stenotrophomonas rhizophila），MG7 特有菌种加纳醋酸杆菌、 解没食子酸链球菌和解脲金黄杆菌，MG10 特有菌种地衣芽孢杆菌，MG11特有菌种黄色微球菌和MG13 特有菌种约氏不动杆菌，这些嗜冷菌可能来源于挤奶设备和饲料等环境中[29-32]，说明同一地区不同牧民家庭生产的酸马奶中的菌种会因为各自不同的生产方式及作坊环境而产生差异[33]。然而，在发酵过程中随着pH值的下降，这些致病菌死亡，因此用纯培养方法未分离到。通过本研究至少检测到这些菌株曾在酸马奶发酵过程中留下的痕迹。

本文采用纯培养技术和PacBio SMRT 测序方法分析了传统酸马奶中的乳酸菌多样性，在12份样品中共分离到62 株乳酸菌，分别为3 个属，6个种，优势菌种为瑞士乳杆菌。通过PacBio SMRT测序技术共检测到细菌的4 个门，24 个属，42 个种，其中属于乳酸菌有5 个属，20 个种。通过测序技术除检测到纯培养获得的菌株外，还检测到一些痕量乳酸菌和其它细菌种属的痕迹。利用PacBio SMRT 测序技术可全面了解酸马奶中细菌多样性，并丰富其中乳酸菌资源数据，为后续优良菌种的筛选提供基础数据。