沙利度胺对宫颈癌裸鼠移植瘤的放疗增敏作用及其机制研究

杨丽萍 侯俊德 刘凌凌 马建彩 王玉红 孟慧芳

宫颈癌是严重危害妇女健康和生命的最常见恶性肿瘤之一[1]，其发病率及病死率在我国呈上升趋势，且日趋年轻化[2]。目前放疗是宫颈癌的重要辅助治疗手段，然而，肿瘤细胞本身对放疗的敏感性较差，如何提高实体瘤的放疗敏感性一直是放疗生物学的重要课题。因此，寻找一种放疗增敏剂是当前研究的热点。有研究证实沙利度胺可增强食管癌、结肠癌细胞的放疗敏感性[3-4]，但沙利度胺与宫颈癌放疗敏感性关系的研究较少见。本研究通过建立人宫颈癌裸鼠移植瘤模型，观察沙利度胺对宫颈癌的放疗增敏作用，并探讨其可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 细胞来源和实验动物 人宫颈癌细胞株Hela亲本细胞株来源于中国科学院上海细胞库，由河北医科大学细胞实验中心提供。在含10%FBS的DMEM培养基中贴壁生长，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，每3～4d传代一次。5周龄雄性BALB/c裸鼠20只，体重20～23g，购于河北医科大学动物实验中心，并在该校实验室SPF级别动物房普通饲料喂养，自由饮水。

1.2 主要试剂及设备仪器 沙利度胺（批号：20030302，规格：25mg/片）购自江苏常州制药厂，小鼠抗人血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）单克隆抗体（批号：1467P306）和即用型细胞免疫组化（SABC法）试剂盒（批号：SA1022）购自北京中山生物技术工程公司，电子数显卡尺购自成都成量工具有限公司（精确度0.01mm），电子天平（FA2004型）购自美国Chem Focus公司。

1.3 模型建立与实验分组 收集处于对数生长期的Hela细胞，稀释至1×107/ml；无菌条件下将0.2ml Hela细胞悬浊液接种于所有BALB/c裸鼠。1周后测得所有裸鼠均已成瘤，且移植瘤的直径达到8mm。采用随机数字表法将20只小鼠分为对照组、沙利度胺组、单纯放疗组（20Gy组）和沙利度胺联合放疗组（沙利度胺+20Gy组）4组，每组5只。对照组：腹腔注射0.2ml 0.5%羧甲基纤维钠，1次/d，连续14d；沙利度胺组：沙利度胺用0.9%氯化钠注射液配成25mg/ml，腹腔注射0.2ml沙利度胺溶液，1次/d，连续14d；20Gy组：照射时小鼠处于麻醉状态（用5%水合氯醛，按0.005ml/g腹腔注射，麻醉成功后，将其捆绑固定），用6MVX线照射，按常规放疗，2Gy/d，5次/周，共10次；照射部位为裸鼠腋部移植瘤瘤体，其余部位用铅屏蔽处理；沙利度胺+20Gy组：腹腔注射0.2ml沙利度胺溶液，1次/d，连续14d；放疗措施同20Gy组。

1.4 肿瘤体积和抑瘤率测定 治疗第1天开始用电子数显卡尺测量肿瘤的最长径（L）和最短径（W），每2d测量 1 次，并计算移植瘤体积（V），V=L×W2×π/6，其中系数π/6≈0.52。治疗后第14天颈椎脱臼处死动物，剥瘤称重（g），计算抑瘤率，抑瘤率=（对照组平均瘤重－给药组平均瘤重）/对照组平均瘤重×100%。取出皮下移植瘤，用10%甲醛固定后，制成石蜡切片备用。

1.5 移植瘤组织中VEGF的免疫组化检测 移植瘤标本经固定、包埋、切片后，按免疫组化SABC法进行染色，检测移植瘤组织中VEGF的表达。操作步骤严格按试剂说明书，PBS代替一抗作阴性对照。结果判断标准：VEGF以胞膜或胞质出现棕黄色均匀颗粒的为阳性细胞。在400倍光镜下随机选取 10个视野，分别计数每个视野内的阳性细胞数，计算阳性细胞的百分比：＜10%为阴性（-），10%～33%为弱阳性（+），34%～66%为阳性（++）；＞66%为强阳性（+++）。

1.6 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组裸鼠肿瘤体积比较 如图1所示，以观察时间作为横轴、移植瘤体积作为纵轴，绘制移植瘤生长曲线。治疗前各组宫颈癌Hela肿瘤体积比较差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗后14d对照组、沙利度胺组、20Gy组和沙利度胺+20Gy组肿瘤体积分别为（0.85±0.14）、（0.71±0.12）、（0.66±0.10）和（0.51±0.09）cm3。与对照组比较，沙利度胺组、20Gy组和沙利度胺+20Gy组肿瘤体积均明显减小，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与沙利度胺组和20Gy组比较，沙利度胺+20Gy组肿瘤体积均明显减小，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

图1 4组移植瘤生长曲线比较

2.2 各组裸鼠瘤重和抑瘤率比较 治疗后14d，与对照组比较，沙利度胺组、20Gy组和沙利度胺+20Gy组瘤重均明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与沙利度胺组和20Gy组比较，沙利度胺+20Gy组瘤重均明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与对照组比较，沙利度胺组、20Gy组和沙利度胺+20Gy组抑瘤率均明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与沙利度胺组和20Gy组比较，沙利度胺+20Gy组抑瘤率均明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2。

2.3 各组裸鼠移植瘤组织中VEGF的表达情况比较对照组、沙利度胺组、20Gy组和沙利度胺+20Gy组裸鼠移植瘤组织中VEGF表达分别呈强阳性、阳性、阳性和弱阳性，后3组与对照组相比VEGF表达均下降，其中沙利度胺+20Gy组下降最明显，见图2。

表2 治疗后14d各组裸鼠瘤重和抑瘤率比较

图2 各组裸鼠移植瘤组织中VEGF的表达情况比较（a：对照组；b：沙利度胺组；c：20Gy组；d：沙利度胺+20Gy组；SABC法，×400）

3 讨论

放疗是多数实体瘤的主要治疗手段，如何提高实体瘤的放疗敏感性一直是放疗生物学的重要课题。近年来兴起的分子靶向治疗不仅具有独特的抗肿瘤作用，而且与传统的放化疗具有明显的协同作用[5-6]。沙利度胺曾因严重的致畸作用而被禁用，但对其研究并未停止。近年研究发现，沙利度胺具有抗肿瘤作用，并可通过直接抑制VEGF表达，调节细胞迁移和黏附，抑制血管形成[7]。VEGF是最重要的促血管生成因子之一，其与肿瘤的发展及放疗敏感性密切相关[8-9]。有研究表明VEGF在宫颈癌组织中高表达，且与肿瘤分期、转移、预后有关[10]。国内外已有报道沙利度胺用于多种实体瘤的治疗[11-14]。但沙利度胺与放疗结合治疗宫颈癌的研究较少报道。本研究通过建立人宫颈癌裸鼠移植瘤模型，观察沙利度胺对宫颈癌的放疗增敏作用，希望将抗血管生成药物与放疗结合起来治疗宫颈癌以期获得更好的疗效。本研究显示，沙利度胺组、20Gy组和沙利度胺+20Gy组肿瘤体积和瘤重均低于对照组，差异均有统计学意义；且与沙利度胺组、20Gy组相比，沙利度胺+20Gy组均明显降低，差异均有统计学意义。此结果表明沙利度胺与放疗都能抑制移植瘤生长，且沙利度胺够增强裸鼠移植瘤细胞对放疗的敏感性。免疫组化结果提示沙利度胺组、20Gy组VEGF表达呈阳性，而沙利度胺+20Gy组VEGF表达呈弱阳性，均低于对照组的强阳性。提示沙利度胺放疗增敏作用可能与抑制VEGF的表达有关，并通过抑制VEGF的表达来增强其放疗作用。

本研究证实了沙利度胺联合放疗能够显著提高Hela宫颈癌小鼠移植瘤的放疗敏感性，其机制可能与降低肿瘤组织中VEGF的表达有关，为沙利度胺成为新型放疗增敏药及临床治疗宫颈癌提供了理论依据。