实时荧光定量 PCR 在皮肤结核诊断中的应用

满春花 糜自豪 孙乐乐 卢宪梅 王 川 王建文陈学超 刘永霞 陈声利 刘 红 张福仁1，

皮肤结核(Cutaneous tuberculosis, CTB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的一种慢性感染性疾病，占皮肤科门诊量的0.034%～0.26%[1-5]，占结核病的比例小于1%～2%[6,7]。CTB临床表现多样[8]，诊断困难。CTB组织病理可呈现结核性肉芽肿，伴干酪样坏死，有利于诊断，但由于机体免疫力强弱不同，干酪样坏死可缺乏，甚至呈非特异性炎症反应[9,10]，因此CTB确诊往往还需依赖于抗酸染色、细菌培养、PCR等病原学方法。抗酸染色敏感性在0～13.8%[11,12],且无法与其它分枝杆菌相鉴别[13]；细菌培养可进行菌种鉴定，敏感性相应提高[12,14]，但耗时长，需9.5～17.3天[15-17]；随着分子生物学方法的发展，基于MTB片段扩增的PCR技术成为CTB诊断的有力工具，但普通PCR技术易受污染DNA的影响而出现假阳性[18]，在临床应用受限。实时荧光定量 PCR (Real time fluorescence quantitative PCR, qPCR)在结核中特异性达100%，敏感性达85%[19]，近年来越来越多的应用于结核的诊断中。该技术应用于CTB新鲜组织MTB的检测中敏感性为24.5%～33.3%[12,14]。但CTB患者初诊时往往会因临床表现不典型，未留取新鲜组织用于qPCR检测，而二次取材患者依从性差、亦增加患者负担，既往研究已经证实qPCR可应用于系统结核石蜡包埋组织病原菌的检测，敏感性为74.6%[20]。本文拟采用qPCR技术检测CTB石蜡包埋组织及新鲜组织中的MTB，并初步比较在两种组织中检测的敏感性，以探讨在CTB石蜡包埋组织中开展MTB检测的可行性。

1 对象和方法

1.1 研究对象

1.1.1 新鲜组织样本 2017年8月至2018年3月山东省皮肤病医院病理科确诊为CTB的新鲜组织样本。所有参与研究的患者均签署了知情同意书。

1.1.2 石蜡包埋组织样本 山东省皮肤病医院病理科2012年1月至2018年3月确诊为CTB的石蜡包埋组织样本。

1.1.3 确诊标准 所有确诊样本除临床和病理符合《中国临床皮肤病学》CTB诊断外[21]，还必须满足下列条件一条以上且抗结核治疗有效方可入组：有现症其它脏器结核；PPD试验阳性或强阳性；T-SPOT.TB阳性[22]。

1.2 DNA的提取

1.2.1 新鲜组织DNA的提取 从皮损中切取约0.3×0.3×0.3 cm3组织块。在无污染的情况下，用手术刀切小碎块，将小碎块转移至2 mL EP管中。使用新鲜组织DNA提取试剂盒(德国Qiagen公司，51306)提取组织DNA，最后将其溶解于AE溶解液中。

1.2.2 蜡块组织DNA的提取 用蜡块切片机切取13片6μm厚度蜡块，即刻放入1.5 mL灭菌EP管内。使用蜡块组织DNA提取试剂盒(德国Qiagen 公司，56404)提取DNA，最后将其溶解于ATE溶解液中。

1.2.3 DNA的质控和浓度的标准化 我们应用紫外-可见光分光光度计(Nano Drop 8000，美国Thermo Fisher公司)进行了DNA浓度的检测，确保提取的DNA质量；浓度的标准化，对于浓度为50 ng/μL以上的标本，我们用无菌的双蒸水稀释为50 ng/μL；对于浓度低于50 ng/μL的标本，我们直接进行检测。

1.3 qPCR检测 应用达安基因公司的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒(PCR-荧光法，Cat.#DA-052)进行检测。PCR反应体系体积为50 μL，其中包括模板DNA 2 μL，退火温度为55℃，扩增循环数为40，操作在AB 7500荧光定量PCR系统(美国应用生物系统公司)上进行。

2 结果

2.1 基本信息 患者基本信息及临床诊断见表1。研究共纳入确诊CTB病例20例，包括寻常狼疮(Lupus vulgaris，LV)11例和疣状皮肤结核(Tuberculosis verrucosa cutis，TVC)9例。男12例，女8例，男女比率为1.5∶1，平均年龄为(51±13.1)岁。其中6例同时有新鲜组织和石蜡包埋组织(1例LV、5例TVC)，14例仅有石蜡包埋组织(10例LV和4例TVC)。全部确诊病例中抗酸染色阳性3例(1例LV、2例TVC)。

表1 全部样本检测结果

注：“+”代表阳性，“-”代表阴性，“未做”代表未做此项检查。

2.2 qPCR检测结果 在6例新鲜组织中，3例(1例LV、2例TVC)qPCR检测MTB阳性，敏感性为50%(3/6)(表1)；20例石蜡包埋组织中，7例(4例LV、3例TVC)经qPCR检测MTB阳性，敏感性为35%(7/20)。其中同时有新鲜组织和石蜡包埋组织的6例患者，2例在两种组织中qPCR检测MTB均为阳性，1例新鲜组织为阳性，石蜡包埋组织为阴性。

3例抗酸染色阳性，敏感性为15%(3/20)。抗酸染色阳性的病例qPCR敏感性为100%(3/3)，抗酸染色阴性的病例为29.4%(5/17)。

3 讨论

CTB是一种古老的传染性疾病，占结核病的比例小于1%～2%[6,7]。近年来结核的防治卓有成效，但随着艾滋病感染率的升高和多耐药菌株的增加[23]，2017年全球结核新发病例数仍为1000万例[24]，相应地CTB的发病人数不容忽视。CTB临床表现多样，分类众多。其中按皮损中MTB的多少，分为多菌型和少菌型[25]。多菌型CTB因皮损中含菌量多，抗酸染色可为阳性；少菌型CTB皮损中含菌量少，抗酸染色多为阴性[26]，病原学诊断困难。我们的样本仅有LV和TVC两种少菌型,平均年龄为(51±13.1)岁,较文献报道大[27,28]，抗酸染色的阳性率为15%。

qPCR技术是一种新兴的病原学检测方法，相比PCR技术，实现了从定性到定量检测的飞跃，目前广泛应用于生物、医药等领域。其操作简单、检测快速，敏感性高、特异性好，近年来越来越多的应用于结核的诊断中。qPCR技术应用于CTB新鲜组织MTB的检测中敏感性为24.5%～33.3%[12,14],然而由于CTB临床表现多样，误诊率高达50%～52.8%[28,29]，因而在初诊病理取材时，初诊医生往往未想到留取新鲜组织用于qPCR检测。当组织病理提示可能为CTB的诊断，只能二次取材，但这不仅增加患者痛苦，而且依从性差，因此探讨应用石蜡包埋组织进行qPCR检测非常必要。

Nilgün Senturk认为CTB石蜡包埋组织PCR的敏感性降低[30]。温晶发现麻风新鲜组织qPCR的敏感性优于石蜡包埋组织[31]。我们应用达安基因公司的qPCR检测试剂盒检测经前述入选标准确诊的20例CTB的石蜡包埋组织和新鲜组织，总的敏感性为40%(8/20)，其中新鲜组织样本敏感性为50%(3/6)，石蜡包埋组织样本敏感性为35%(7/20)。与既往报道一致，新鲜组织检测的敏感性高于石蜡包埋组织[31],但无论是对新鲜组织还是石蜡包埋组织检测的敏感性均高于文献报道对新鲜组织检测的敏感性，而且我们的病例只有少菌型，文献中的病例同时包括少菌型和多菌型[12,14]。同时有新鲜组织和石蜡包埋组织的6例患者，2例在两种组织中qPCR检测MTB均为阳性，1例新鲜组织qPCR检测阳性，石蜡包埋组织中qPCR检测结果是阴性。石蜡包埋组织假阴性结果可能是由于MTB在皮损中的分布并不均匀[14]，或者是福尔马林导致的核酸和蛋白质交联[32]、DNA降解导致的石蜡包埋组织的DNA提取效率下降。据文献报道蜡块样本一般固定时间越久，扩增效率越低，超过5年的样本扩增的效率明显降低[33]。但我们有1例LV和1例TVC是固定5年以上的，检测出了MTB。但样本量较少，缺乏代表性。

抗酸染色是检测结核杆菌的基本病原学方法，可应用石蜡包埋组织进行检测，但对阅片人员的要求高，敏感性低，而且不能区分非结核分枝杆菌、诺卡氏菌、棒状杆菌[13]。我们的样本抗酸染色敏感性为15%,低于qPCR检测的敏感性。Mmed报道抗酸染色阳性的样本中PCR阳性率为55.6%(5/9),抗酸染色阴性的样本PCR结果均为阴性[34]。Tan报道抗酸染色阳性(多菌型)的样本PCR阳性率为64.3%(9/14)。在少菌型CTB样本中，TVC敏感性为55%，LV为60%[35]。我们的样本所有抗酸染色阳性的样本qPCR检测均为阳性。在抗酸染色阴性的样本中敏感性为29.4%(5/17)，其中LV为30%(3/10),TVC为28.6%(2/7)。

我们的研究结果表明qPCR技术可应用于CTB新鲜组织及石蜡包埋组织中MTB的检测，较之抗酸染色等传统技术，qPCR敏感性、特异性更高，可辅助CTB的早期确诊。在临床工作中，如初诊考虑到CTB的诊断，建议病理取材时一并留取新鲜组织进行qPCR检测；如临床表现不典型，在病理提示CTB诊断可能性时，利用石蜡包埋组织开展qPCR检测也是协助病原学诊断的一种重要方式。