模拟酸雨对华重楼生理生化特性的影响①

王春燕

（四川师范大学生命科学学院 四川成都610066）

环境问题是当今国际社会的普遍问题，我国的环境问题也比较严重，其中，酸雨已成为生态学研究的热点之一，因其对植物可能造成不可估量的损失，引起研究者们的广泛关注［1]。随着我国经济的迅速发展，化石燃料使用量的日益剧增，大气质量的日益下降，我国的酸雨问题日益严峻，已成为全球第三大酸雨区［2-4]。我国酸雨区主要分布在长江以南，其中西南、华南地区尤为严重，大部分降水的pH 值低于4.5［5]。有关酸雨对陆生植物生长发育及生理特性的影响国内外已有较多报道，其中酸雨对黄瓜叶片、甜菜叶片、桦树根系等抗氧化系统的研究表明，酸雨对SOD、POD、CAT 活性的影响随着酸雨胁迫时间、胁迫强度及植物种类的不同而出现不同的规律［6]。酸雨会使植物叶片变黄脱落，破坏植物叶片结构，降低叶绿素含量，影响植物酶活性［7]。

华重楼（Paris polypHyllavar. chinensis），又称七叶一枝花，是我国传统中药，主要分布于我国西南部的云南、四川和贵州一带，具有清热解毒，消肿止痛、止血、治疗跌打损伤、祛痰、抑菌、抗早孕等功效，是云南白药、热毒清、季德胜蛇药片和宫血宁等中成药的主要原材料［8]。华重楼为多年生草本植物，繁殖率较低，地下根状茎生长十分缓慢，从种子发芽到入药一般需10～15年。近年来，由于大量采挖，野生华重楼资源日益减少，严重威胁以其为原料的医药工业的可持续发展，因此，人工栽培成为必然趋势，而酸雨对华重楼栽培的影响不可忽视。本文主要以四川大渡河的华重楼为研究对象，通过不同pH 模拟酸雨溶液处理，研究酸雨胁迫对植物各项生理指标的影响及变化规律，为华重楼人工栽培管理提供科学依据［9-10]，为进一步开展酸雨环境对华重楼生长的胁迫机理和华重楼的逆境生理研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验地与材料

试验地点为四川师范大学生物实验园。该实验园位于成都郊区，属亚热带温湿季风气候，年平均降雨量为881.9mm，其中酸雨率为30%左右。每年7～9月为酸雨高发期，其中8月酸雨率最高，达到36.7%。

选择长势、形态基本一致的野生华重楼75株，2015年5月移栽入上、下口直径分别为35、25cm，高30cm 的塑料花盆中，每盆1 株，对所有苗盆进行编号、挂牌，用壤土精细栽培，缓苗期间用自来水浇灌，6月开始喷洒酸雨。

1.2 方法

1.2.1 模拟酸雨溶液配制

用98%的浓硫酸和68%的浓硝酸配置3 种不同比例的母液：H2SO4∶HNO3（V/V）＝8∶1；H2SO4∶HNO3（V/V）＝1∶1 和H2SO4∶HNO3（V/V）＝1∶8，用蒸馏水将各母液稀释成pH5.5、4.5、3.5、2.5 的酸雨喷洒液［11]。每次酸雨喷淋量根据当地月均降雨量确定。注意整个酸雨喷施试验需在透光的塑料大棚中进行，以减少自然降雨的影响，同时用pH6.8的蒸馏水喷施作为对照。

1.2.2 试验设计

采用完全随机区组设计，将华重楼随机分成5 组，每组15 株。根据成都地区多年月均降雨量计算每次模拟酸雨喷淋量，对各组华重楼植株分别喷淋已配制好的pH 值为2.5、3.5、4.5、5.5 的模拟酸雨溶液，每组喷淋相同pH 值溶液，不同组喷淋不同pH 值溶液，每次每盆植株的喷淋量约100mL，同时做对照试验［12]。所有盆栽植株每隔7 d 喷淋一次。整个试验期间除喷施酸雨的浓度不同外，其余环境条件保持一致。

1.2.3 测定指标与方法

酸雨胁迫处理7 d 后，随机选择不同组植株各3 株，选取长势良好的叶片测定光合色素含量、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、丙二醛（MDA），每个生理指标测定3 次［13]，取平均值。叶面积测定采用SHY-150型活体扫描式叶面积仪。

鲜叶中叶绿素含量的测定：采用乙醇提取法分别测定665、649 和470 nm 的OD值，按公式计算组织中各色素的含量。

丙二醛（MDA）的含量测定：采用硫代巴比妥酸（TBA）法测定其含量［14]。

酶活性测定：采用愈创木酚法测定过氧化物酶（POD）活性［15]；氮蓝四唑（NBT）光还原法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性。

1.3 数据统计

采用Excel 2010 和SPSS 19.0 进行数据统计和单因素方差分析（One-way ANOVA），采用LSD 多重比较法检验各处理间差异显著性（p＜0.05），并作图。

2 结果与分析

2.1 酸雨胁迫对华重楼叶片的伤害

由表1可知，CK处理后，华重楼的叶片未出现可见伤害；pH5.5 酸雨处理后，华重楼叶片出现轻微伤害；随着酸雨酸度的增加，华重楼叶片的伤斑面积随之扩大。pH4.5 酸雨处理后，华重楼叶片出现较明显的伤害；pH3.5 酸雨处理后，华重楼叶片出现明显伤害；pH2.5 酸雨处理后，华重楼叶片出现伤斑。

表1 在不同酸度的模拟酸雨处理下华重楼叶片的伤害程度

2.2 酸雨胁迫对华重楼叶绿素含量的影响

由表2～3 可知，CK 处理后，华重楼叶片叶绿素含量最高；当pH5.5～6.8 时，华重楼叶片叶绿素含量与对照相差不大；pH低于4.5时，叶绿素含量急剧降低；与对照相比，pH 值为2.5 时，华重楼叶片叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a + b 和叶绿素a/b分别降低了73.21﹪、67.21﹪、70.71﹪、17.98﹪。不同pH 模拟酸雨溶液处理下华重楼叶片的叶绿素总量和叶绿素a/b 含量均有一定程度的降低。pH3.5 模拟酸雨溶液处理的华重楼叶片内叶绿素a和叶绿素总量达与对照差异显著。

表2 模拟酸雨处理下华重楼叶片中叶绿素a和叶绿素b的含量

表3 模拟酸雨处理下华重楼叶片中叶绿素a+b的含量和叶绿素a/b比值

2.3 酸雨胁迫对华重楼叶片丙二醛含量的影响

由表4 可知，CK 处理华重楼叶片丙二醛（MDA）含量最低；pH5.5～6.8 时，随着pH 的降低华重楼叶片MDA 含量迅速增加；pH3.5～5.5时，随着pH 值的降低，华重楼叶片MDA 含量缓慢增加；当pH 值在2.5～3.5 之间时，随着pH 值的降低，华重楼叶片MDA 含量迅速升高。与对照相比，pH2.5 时，模拟酸雨处理15、30、45 d 后华重楼叶片MDA 含量分别增加了52.43%、56.04%、29.16%，此时华重楼叶片受到严重伤害，膜脂过氧化作用增加，膜受到一定伤害，使丙二醛的含量急剧增加。

2.4 酸雨胁迫对华重楼叶片抗氧化酶活性的影响

在逆境胁迫下，植物体内的活性氧数量剧增，植物的抗氧化酶活性迅速升高，对清除活性氧起到重要应激反应，成为环境胁迫下植物应激反应的重要检测指标［16]。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）是抗氧化酶系统中控制植物体内活性氧积累的最主要的酶，SOD 是植物抗氧化的第一道防线，能清除细胞中多余的超氧阴离子；POD 可以使H2O2歧化成无毒害的水和氧分子。

表4 在不同酸度的模拟酸雨处理下华重楼叶片丙二醛的含量

2.4.1 酸雨胁迫对华重楼叶片过氧化物酶（POD）活性的影响

由图1可知，pH5.5～6.8时，华重楼叶片过氧化物酶POD活性趋于稳定；pH2.5～5.5时，华重楼叶片过氧化物酶POD 活性随pH 值得的降低呈迅速上升的趋势，其中pH2.5～3.5时，POD活性变化最为明显。

图1 模拟酸雨对华重楼叶片过氧化物酶POD活性的影响

2.4.2 酸雨胁迫对华重楼叶片超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响

由图2可知，用不同酸度的模拟酸雨处理华重楼15、30、45 d 后，华重楼叶片中超氧化物歧化酶（SOD）活性变化趋势是一致的，都是随着pH的降低，SOD活性呈迅速上升的趋势。

3 讨论

酸雨与植物互作是个非常复杂的过程，一方面酸雨破坏植物叶片表皮和细胞膜结构，另一方面植物受到酸雨胁迫时，体内的抗氧化酶系统激活，进而清除体内由于酸雨胁迫引起过量的活性氧（ROS）［17]。有研究表明，施与植物适当强度的锻炼或预胁迫，可以增强植物在逆境中的生存能力和抵抗力。本试验通过模拟酸雨处理，华重楼叶片出现不同程度的可见伤害，同时叶片内的SOD活性和POD活性均有不同程度的上升，这可能是由于酸雨胁迫过程调节的结果，在逆境中华重楼的抗氧化酶活性等生理指标也发生了明显变化［18-19]。

图2 模拟酸雨对华重楼叶片超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响

酸性环境胁迫下，MDA 是反映膜脂过氧化程度以及膜结构稳定性最直接的指标，可用于衡量细胞膜受伤害的程度［20]。酸雨可影响细胞活性氧代谢系统的平衡，破坏活性氧清除酶系［21]，有研究报道表明，酸雨使植物的丙二醛（MDA）含量增加，膜保护酶超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD），脂质过氧化作用增强。SOD 活性增加，可抵抗由于酸雨造成体内活性氧的增加，从而抑制膜脂的过氧化作用，但是倘若酸雨胁迫强度超过植物体SOD的耐受限度，则SOD活性会随着pH值下降而逐渐丧失，甚至失去清除活性氧的能力［22]。

4 结论

酸雨对华重楼叶片可见伤害的典型症状是叶片退绿变淡，叶面有黄褐色伤斑；严重的会造成叶片枯萎，提前脱落。叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，在光合作用的光吸收中起着核心的作用。酸雨胁迫下，植物的光合作用在可见伤害发生前已经明显受到抑制。本试验中不同pH 值模拟酸雨处理条件下，华重楼叶片叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a +b 和叶绿素a/b 的变化趋势一致，都是随着pH的增加而增加。

本试验结果表明，华重楼叶片生长的各项指标对酸胁迫的敏感度不一样。弱酸处理对华重楼叶片保护酶活性无显著影响，但局部会有波动，这是受酸性条件胁迫后，华重楼叶片内过氧化产物增多而启动的一种应激机制。当叶片内氧化产物积累到一定水平后，华重楼叶片内保护酶（SOD，POD）活性随酸性的增强而急剧降低。

目前，有关酸雨对药用植物华重楼生长的影响研究不多，尤其是对华重楼抗氧化酶系统的研究较少。因此，有必要在研究华重楼抗氧化系统的同时考察植物次生代谢产物含量的变化，将华重楼的生理变化和有效成分研究相结合，将华重楼在逆境下各项变化与该药材的形成与发展相结合。