替加环素中有色杂质测定

魏 娜，孟文娟，何 雷，王珍珍

(江苏豪森药业集团有限公司，江苏 连云港 222000)

替加环素是第一个被批准的新型静脉注射用甘氨酰四环素类抗生素，有广谱抗微生物活性，用于治疗由革兰阴性或阳性病原体、厌氧性生物及耐甲氧西林金葡菌(MRSA)和甲氧西林敏感金葡菌(MSSA)导致的clA1,DSSSI，替加环素向医生们提供了一种新的、可在治疗初期当病因尚未明了时供选择的广抗生素，并且不需根据肾功能受损情况调整剂量，使用方便，每12 h服用一次即可。替加环素是由美国辉瑞(原惠氏)公司研究开发，于2012年初在中国上市，2013年初有国内仿制药上市。药品在出厂到储藏、运输、存放、销售等环节，如处置不当会影响药品外观颜色，特别是在贮藏期间受不同温度、不同湿度、空气质量、光线强弱等因素的干扰，容易引起降解，可能产生有毒性的有色杂质[1]。替加环素作为一种注射用抗生素药品，其有色杂质控制更为重要。

1 有色杂质的检测方法

溶液颜色检查法广泛应用于化学药品的质量控制，目前，在2015版中国药典通则0901溶液颜色检查法中列出了几种检测方法：第一法(比色法)、第二法(紫外-可见分光光度法)、第三法(色差计法)。目视检查法较为常用，但主观误差大，易受到外界照明条件及观察者心理、生理及环境等因素的影响，对颜色不能进行量化的测定，对与标准比色液色调不一致和限度边缘的样品基本无法判定，造成结果判定差异。分光光度法通过对标准比色液在可见光区吸收情况进行考察，选择各色调的最大吸收波长测定各色号的吸收度在一定程度上可以控制药品溶液颜色，但药品颜色往往不是单一波长所能表现的，也就是说在单一波长处的吸收度不能完全反映药品颜色的全部特性。色差计是根据完整、成熟的色度学理论设计而成，该方法在很大程度上弥补了目视检查法与分光光度法的不足，能够客观数字化的反映判断结果，使药品标准的判定更具科学性、严谨性[2]。

2 杂质来源分析

参考相关文献，替加环素容易氧化降解，在室温条件下，溶解于水中，敞口搅拌数小时颜色由黄色/橘色变至深绿色。原研专利中，对替加环素进行了氧化破坏，使用制备色谱得到了有色杂质(图1)，并使用NMR和HRMS对有色杂质进行了结构确认，发现替加环素氧化降解时，B环打开形成羧酸和羟基、D环羟基氧化为醌而生成有色杂质，该杂质即为USP方法中的开环杂质。

图1 替加环素氧化得到有色杂质

3 检测方法开发

参考注射用替加环素相关文献，确定采用色差计法对替加环素原料中可能降解产生的有色杂质进行控制：取替加环素0.10 g，精密称定，加0.02 mol/L盐酸水溶液10.6 mL使溶解，混匀，静置15 min后加入1 cm比色皿中，立即采用色差计测定替加环素与纯化水的L*、a*、b*相对值，并利用公式计算“计算颜色值”(CCV,calculated color value)=2.19×L*+2.59×a*-0.48×b*。

该有色杂质无明显的警示结构，在替加环素USP质量标准中，有关物质中未知单杂的限度为不大于0.10%。在色差计颜色的方法研究中，不同浓度的有色杂质含量与CCV值有明显的对应关系，当样品中添加有色杂质为0.10%时，计算颜色值为103，因此将计算颜色值即CCV值标准定为不小于100。

4 结果与讨论

(1)仪器准确度：考察USP的J、L、O号标准比色液，结果表明仪器准确度很好。

(2)仪器专属性：考察USP的J、L、F、O、Q号标准比色液，结果表明仪器的专属性很好。

(3)仪器重复性：考察USP的 L号标准比色液，结果表明重复性好。

(4)溶剂选择： 0.02 mol/L盐酸乳酸钠林格溶液、0.02 mol/L盐酸氯化钠溶液、0.02 mol/L盐酸葡萄糖溶液、0.02 mol/L盐酸溶液四种溶剂的CCV值显示溶剂种类对结果无影响。当稀释液为0.02 mol/L盐酸时，替加环素溶液的pH值和CCV值与制剂相似。

(5)溶液稳定性：替加环素溶液在0～2 h内，RSD为0.49%，溶液稳定性很好。

(6)精密度：替加环素溶液10次测定的CCV值RSD为0.29%，精密度很好。

(7)线性：有色杂质浓度范围为0～38.12 μg/mL时，线性关系良好(n=10)，线性回归方程为CCV = -2.3980×C + 216.0197，相关系数 r=0.9974。

(8)准确度：不同浓度有色杂质加入量与CCV值有非常明显的变化趋势，即有色杂质的浓度越大，对应的CCV值越小。

(9)耐用性：复溶体积10.6 mL±0.2 mL与静置时间15 min±2 min在样品处理过程中耐用性良好。